一种新的造血干/祖细胞的富集方法及其体外定向诱导分化

摘要

本发明包括利用脐带血中含有细胞成分的不同的理化性质，利用B淋巴细胞与尼龙棉吸附及单核/巨噬细胞与塑料制品吸附的特点，采用两步法负性富集的方法获得富集的人造血干/祖细胞，既克服了传统的免疫磁珠分离体系价格昂贵及含有磁珠的缺点，又保留了细胞成分中的晚期祖细胞及对造血有支持作用的细胞成分，为今后临床体外诱导分化的细胞用于造血损伤修复提供了可行的方法。体外定向诱导分化实验表明此细胞可高效向红系及粒系细胞定向诱导分化。

主权项

1. 一种富集人造血干/祖细胞的方法，其特征在于它按下述步骤进行：(1)单个核细胞的分离；按1∶1的比例将抗凝血与PBS混匀，再向其中加入1/4体积的0.5％甲基纤维素，混匀后室温静置，待红细胞自然沉降至界限分明，吸出上清，置于离心管中，室温下1500rpm离心5分钟，小心弃上清，加PBS重悬细胞，然后在离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，再缓慢沿管壁加入5ml细胞悬液，20℃、1500rpm离心20分钟，分离收集界面单个核细胞，PBS洗涤一次，再以PBS重悬细胞，计数备用；(2)制备尼龙棉柱：取10克尼龙棉，撕成细丝后用1％盐酸浸泡2小时，再用蒸馏水洗净，晾干后将其加入到10ml的注射器针筒中，高压蒸汽灭菌备用；(3)去除B淋巴细胞：将尼龙棉柱底部接三接头活塞，悬置于架子上，用PBS洗涤3次，关闭活塞，均匀加入悬浮的单个核细胞到尼龙棉柱中，使细胞悬液的液面低于尼龙棉的界面，置37℃孵育1小时后将尼龙棉柱移至超净台内，柱下端置一灭菌的小瓶用于收集细胞，移取柱上的盖子，从柱端加入含5％FBS的PBS缓冲液，使其以重力将未黏附于尼龙柱上的细胞冲下，持续加入缓冲液，直到收集到3倍柱体积的液体，将细胞离心，收集的细胞即为去除了B淋巴细胞的细胞；(4)单核/巨噬细胞的去除：用IMDM培养基重悬去除了B淋巴细胞的细胞，将其接种至一次性塑料培养瓶中，37℃孵育2小时后收集未贴壁的细胞；(5)此未贴壁的细胞即为富集的人造血干/祖细胞。