发明名称 微生物病原之检测方法
摘要
申请公布号 TWI311154 申请公布日期 2009.06.21
申请号 TW090132333 申请日期 2001.12.26
申请人 宝生物股份有限公司 TAKARA BIO INC. 日本 发明人 岛田 雅光;日野文嗣;加藤郁之进
分类号 C12Q1/68 (2006.01);C12N15/09 (2006.01) 主分类号 C12Q1/68 (2006.01)
代理机构 代理人 陈长文 台北市松山区敦化北路201号7楼
主权项 1.一种探针,其特征为可检测结核菌群之结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛结核杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠结核杆菌(Mycobacterium microti)、及/或坎尼提结核杆菌(Mycobacterium canetti),其于pH8~14之硷性区域中,可与结核菌群之IS6110基因杂合,并含有序列表之序列编号11之硷基序列。2.如申请专利范围第1项之探针,其在与标的核酸杂合时其萤光强度不会被抑制,而不与标的核酸杂合时其萤光强度则会被抑制。3.如申请专利范围第1项之探针,其5'末端系以若丹明系萤光色素或系萤光色素标志。4.如申请专利范围第3项之探针,其中标志萤光色素系具有报导子(reporter)萤光色素及库恩查(quencher)色素。5.如申请专利范围第4项之探针,其中该报导子色素可为萤光素系色素,而库恩查色素则可为DABCYL系色素。6.如申请专利范围第1项之探针,其系附加选自萤光物质、色素、酵素、生物素、金胶体以及放射性同位素之标志。7.一种结核菌群之检测方法,其系包含使用如申请专利范围第1项的探针于pH13~14之硷性区域中进行杂合反应之步骤。8.如申请专利范围第7项的结核菌群之检测方法,其系使用具有分别表示于序列表之序列编号36、37之硷基序列之引子或具有与该序列一部份重复之序列之引子增幅来自结核菌之IS6110基因及/或其片段后,再进行杂合反应。9.如申请专利范围第7之项结核菌群之检测方法,其系检测以包含以下列步骤之核酸增幅方法所得到之增幅核酸:(a)一调制反应混合物之步骤,其系将作为模板之核酸、去氧核醣核三磷酸、具有股置换活性之DNA聚合、选自由分别表示于序列表之序列编号13~16之硷基序列所组成之嵌合寡核酸引子群中之至少1种类的引子以及RNaseH加以混合;在此,该引子系与作为模板之核酸的硷基序列实质上互补,且至少含有选自去氧核醣核酸或核酸类似物者及核醣核酸,该核醣核酸系于该引子的3'末端或在3'末端侧端配置有嵌合寡核酸引子者;以及,(b)一以生成反应产物所需之充分时间孵育反应混合物之步骤。10.如申请专利范围第9项的结核菌群之检测方法,其系使用含有选自由分别表示于序列表之序列编号13~16之硷基序列所组成之嵌合寡核酸引子群中之2种类的嵌合寡核酸引子之反应混合物之核酸增幅方法。11.一种结核菌群检测用引子,其系选自:(i)分别以序列表之序列编号13~16表示者结核菌群检测用嵌合寡核酸引子;(ii)增幅来自结核菌群之IS6110基因及/或其片段用引子,并具有分别以序列表之序列编号36、37表示的硷基序列;及(iii)(ii)中之引子之硷基序列的一部份被置换成核醣核酸之嵌合寡核酸引子。12.如申请专利范围第10项之引子,其系附加标志之引子。13.如申请专利范围第12项之引子,其系附加有选自萤光物质、色素、酵素、生物素及金胶体之标志。14.一种如申请专利范围第7项之结核菌群之检测方法用组合物,其系含有:(i)申请专利范围第1项之探针;(ii)申请专利范围第10项之引子;(iii)具有股置换活性之DNA聚合;(iv)RNase;及(v)去氧核醣核三磷酸。15.如申请专利范围第14项之组合物,其中该DNA聚合系来自卡朵铁钠杆菌(Bacillus caldotenax)之5'→3'核酸外切缺损之BcaDNA聚合,该RNaseH系来自焦球菌(Pyrococcus)属细菌及/或来自古球菌(Archaeoglobus)属细菌之II型RNaseH。16.一种如申请专利范围第7项之结核菌群之检测方法用套组,其系含有:(i)申请专利范围第1项之探针;(ii)申请专利范围第10项之引子;(iii)具有股置换活性之DNA聚合;(iv)RNase;及(v)去氧核醣核三磷酸。17.如申请专利范围第16项之套组,其中该DNA聚合系来自卡朵铁钠杆菌之5'→3'核酸外切缺损之BcaDNA聚合,该RNaseH系来自焦球菌属细菌及/或来自古球菌属细菌之II型RNaseH。18.如申请专利范围第16项之套组,其系含有用以捕捉增幅产物之载体。19.如申请专利范围第18项之套组,其载体系选自微滴定盘、微珠、磁性微珠、薄膜及玻璃之载体。20.如申请专利范围第7项之结核菌群之检测方法,其系在结核菌群之检测方法中,包含以胞壁酸(Muramidase)处理含有结核菌之检体,并抽出核酸之步骤。图式简单说明:图1系表示根据本发明之方法,在测定各种HCV-RNA浓度时,比较HCV-RNA浓度与萤光强度之变化关系,以及比较与过去方法在测定范围上之差异情形。
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