一种嗜热耐高温葡聚糖磷酸化酶的制备方法

摘要

一种嗜热耐高温的葡聚糖磷酸化酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。该酶的最适酶活温度为75℃，具有较为宽的酶适应温度，在70℃以上具有很高的酶活；该酶的最适酶活pH为6.0。该酶具有独特的底物特异性，其降解方向和合成方向所需的最小糖链长度分别为三糖和二糖，均比普通的葡聚糖磷酸化酶少一个糖基以上。该酶的制备方法，包括质粒、菌株与培养基的选择，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。该酶具有极高的热稳定性，可用于医药、食品、生物工程领域1-磷酸葡萄糖及寡糖的制备。

主权项

1、一种葡聚糖磷酸化酶的制备方法，该葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列如下：MRKHLKGKAH KKLHMIISIT AELGIDFGEN FAGGLGVLEG DKFYASARLG IDYTVFTLFY 60RKGYTGNEEK QKELLKNLVK EWETEIELKK GKIKIEYLTY KLNTAKAIFI NILSPDWAKR 120LNEKLYIENS EEDRFYKYLV LAKATEKYIS EKIGWDKIKY VDLQEAYPSF LPLLKYFPRY 180RIIIHTPAPW GHPTFPARYF KEEFGFEFPF DPVVMTEIGL SSAVQGIVVS KKMLHHVSKT 240FPHHMHKIKA ITNAVEIPRW RHPLLNNVKD LDDFIKKKKE VKKESLKKLG KESDKPTIGW 300VRRITQYKRP EFILRLIDEL RDDVVFIIGG KAHPYEYYGV ELEKKFKEYA QKRNNVIYVQ 360GVDIQQMKLA IWSSDIWTFT PYSGWEASGT SFMKAGVNGV PSVASRDGAV PEIIKDGYNG 420WLYGEDRYEL LPVDTYDREY EEFARKVKEA LNKYYEVGYN AYHTFSDFCS MDRLMKEYAL 480，其特征在于具体步骤如下：(1)菌株、质粒、酶与培养基：大肠杆菌DH5α、限制性内切酶Nco I和Sal I、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL；LB培养基：每升含Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g；氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L；(2)PCR扩增及重组质粒的构建设计一对引物，以Sulfolobus tokodaii strain 7全基因组序列为模板，使用Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，用限制性内切酶Nco I和Sal I酶切后用DNA连接kitver.2.1连接到经同样内切酶酶切的克隆与表达质粒载体pET15b上，该pET15b质粒是经改造将Nco I与Nde I位点互换的，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒；所述引物是：上游5’GCACAGGTTATCTCCATGGGGAAACACTT3’，下游5’GTCAGAGCTGTAGTCGACCTTATAAAGCGTATT3’；(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化将重组质粒转化大肠杆菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1mol/LIPTG于37℃继续培养3-5h，诱导表达的蛋白经过热处理，亲和层析得到纯化的酶蛋白。