一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法

摘要

本发明涉及一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法。利用莱茵衣藻作为转基因受体生物，通过构建含有筛选标记基因表达框架的外源基因高效表达载体构建，利用“珠磨法”、基因抢法、或电击穿孔等方法，将来源于不同生物体(包括动物、植物和微生物等)的目的基因导入莱茵衣藻体内，并根据需要整合到细胞核基因组、或叶绿体基因组中，采用一系列基因表达调控技术，构建转基因莱茵衣藻高效生物反应器。该方法构建的转基因菜茵衣藻生物反应器生长速度快、繁殖周期短、产物易分离、光合自养和可集约化大规模培养等特性，实现快速、廉价生产各种药用蛋白质、工业原料、可食性疫苗、具有生物学活性的次生代谢产物等。

主权项

1、一种转类金属硫蛋白MT-like基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法，它包括下列步骤：A、转基因受体藻的筛选与培养；B、含筛选标记基因表达框架的外源基因莱茵衣藻表达载体构建；C、外源基因的遗传转化；D、外源基因表达调控，其包括外源基因的改造、强启动子的筛选、控制外源目的基因导入莱茵衣藻的融合位置为细胞核基因组或叶绿体基因组；E、培养转MT-like基因的莱茵衣藻，并从中分离类金属硫蛋白；所述的含筛选标记基因表达框架外源基因莱茵衣藻表达载体包括莱茵衣藻强启动子RBCS2启动子，HSP70A-RBCS2合成启动子、atpA启动子，目的基因MT-like、终止子RBCS2终止子，rbcL3′终止子、筛选标记基因ble，aadA，其构建过程包括：(1)外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体的构建：A：首先将载体pSP105上克隆有RBCS2的5′启动子序列和它的3′终止子序列，中间携带有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性内切酶位点，利用相应的酶切位点插入外源基因构成RBCS2的5′启动子、目的基因和RBCS2终止子的表达盒，通过EcoRV酶切位点将该表达盒插入pSP124载体上，pSP124上含有ble基因的表达盒RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子，编码13.5KD的腐草霉素结合蛋白，构建含RBCS2启动子的外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体；B：载体pCB740上克隆有Hsp70A-RBCS2合成启动子，以pCB740质粒为模板，设计上下引物：上游引物：PrHp1/5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT 3′HindIII下游引物：PrHp2/5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA 3′PmaC I通过PCR从质粒pCB740上扩增出含HSP70A-RBCS2启动子片段，经电泳分离后从凝胶中回收，采用T-A克隆策略将其克隆到的pMD18-T载体上，得到的转化子命名为HRT，通过PmaC I和HindIII从重组质粒HRT上分离出HSP70A-RBCS2启动子片段，将pSP105用PmaC I和HindIII双酶切，经电泳分离后从凝胶中回收切除了RBCS2启动子740bp的pSP105质粒片段pSP105-1P，通过T4 DNA连接酶将HSP70A-RBCS2启动子连接到pSP105-1P，得到莱茵衣藻表达载体pH105，利用相应的酶切位点插入外源基因构成HSP70A-RBCS2启动子、目的基因和RBCS2终止子的表达盒，通过EcoRV酶切位点将该表达盒插入pSP124载体上，构建含HSP70A-RBCS2启动子的外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体；(2)外源目的基因莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：首先是利用同源重组片段衣藻叶绿体的psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列将外源基因定点整合到受体细胞叶绿体基因组psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列之间，利用莱茵衣藻叶绿体rbcL基因的5′启动子、rbcL基因的3’终止子驱动外源基因在莱茵衣藻的表达，筛选标记为aadA基因，质粒p53rGFPct上携带有衣藻叶绿体的rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列，通过NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列可以在衣藻叶绿体中表达插入的外源基因，构成rbcL5′启动子-目的基因-rbcL3′终止子的外源基因表达盒，载体p322上携带有衣藻叶绿体psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列，外源基因表达盒插入叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23S rRNA之间的位置构成p322-1；p423质粒上携带有筛选标记aadA基因的表达盒atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子，通过EcoRI和Sacl双酶切p423，获得1.9kb的aadA基因表达盒，连入p322-1的EcoRI和Sacl位点，得到外源基因莱茵衣藻叶绿体表达载体。