酵母细胞表达人白细胞介素10的方法

摘要

本发明是酵母细胞表达人白细胞介素10的方法，技术方案是：人工合成hIL-10全基因序列，包括hIL-10的带有其信号序列和不带信号序列，分别记为shIL-10和nshIL-10，给其两端加上EcorR I和Not I酶切序列或两端都加上EcorR I酶切序列，用EcoR I和Not I分别双酶切目的基因shIL-10、nshIL-10以及毕赤酵母的整合型表达载体pPIC3.5K、pPIC9K，构建重组质粒pPIC3.5K/shIL、pPIC9K/nshIL，然后通过电穿孔、原生质体法转化毕赤酵母细胞，重组质粒和目的基因整合到酵母染色体上，应用甲醇诱导毕赤酵母进行胞内可溶性表达或胞外分泌型表达。本发明与现有在大肠杆菌中表达相比，提高人白细胞介素10的空间结构的正确折叠及其生物学活性，具有明显的优势：①酵母细胞表达hIL-10，不形成变性蛋白的包涵体，蛋白为可溶形式表达，直接形成活性蛋白；②可溶性活性蛋白有利于纯化，纯化得率高，避免包涵体复性时的损失。

主权项

1. 一种制造重组人白细胞介素10的方法，应用酵母表达人白细胞介素10，其特征是：按以下步骤制造：1)按照毕赤酵母偏爱的密码子人工合成hIL-10全基因，核酸序列如下：10 20 30 40 50 60ATGCATTCTT CTGCTTTGTT GTGTTGTTTG GTTTTGTTGA CTGGTGTTAG AGCTTCTCCATACGTAAGAA GACGAAACAA CACAACAAAC CAAAACAACT GACCACAATC TCGAAGAGGT70 80 90 100 110 120GGTCAAGGTA CTCAATCTGA AAATTCTTGT ACTCATTTTC CAGGTAATTT GCCAAATATGCCAGTTCCAT GAGTTAGACT TTTAAGAACA TGAGTAAAAG GTCCATTAAA CGGTTTATAC130 140 150 160 170 180TTGAGAGATT TGAGAGATGC TTTTTCTAGA GTTAAGACTT TTTTTCAAAT GAAGGATCAAAACTCTCTAA ACTCTCTACG AAAAAGATCT CAATTCTGAA AAAAAGTTTA CTTCCTAGTT190 200 210 220 230 240TTGGATAATT TGTTGTTGAA GGAATCTTTG TTGGAAGATT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGTAACCTATTAAACAACAACTT CCTTAGAAAC AACCTTCTAA AATTCCCAAT GAACCCAACA250 260 270 280 290 300CAAGCTTTGT CTGAAATGAT TCAATTTTAC TTGGAAGAAG TTATGCCACA AGCTGAAAATGTTCGAAACA GACTTTACTA AGTTAAAATG AACCTTCTTC AATACGGTGT TCGACTTTTA310 320 330 340 350 360CAAGATCCAG ATATTAAGGC TCATGTTAAT TCTTTGGGTG AAAATTTGAA GACTTTGAGAGTTCTAGGTC TATAATTCCG AGTACAATTA AGAAACCCAC TTTTAAACTT CTGAAACTCT370 380 390 400 410 420TTGAGATTGA GAAGATGTCA TAGATTTTTG CCATGTGAAA ATAAGTCTAA GGCTGTTGAAAACTCTAACT CTTCTACAGT ATCTAAAAAC GGTACACTTT TATTCAGATT CCGACAACTT430 440 450 460 470 480CAAGTTAAGA ATGCTTTTAA TAAGTTGCAA GAAAAGGGTA TTTACAAGGC TATGTCTGAAGTTCAATTCT TACGAAAATT ATTCAACGTT CTTTTCCCAT AAATGTTCCG ATACAGACTT490 500 510 520 530 540TTTGATATTT TTATTAATTA CATTGAGGCT TACATGACTA TGAAGATTAG AAATTAA...AAACTATAAA AATAATTAAT GTAACTCCGA ATGTACTGAT ACTTCTAATC TTTAATT...2)体外构建重组表达载体转化毕赤酵母中，进行胞外的分泌性表达或胞内的可溶性表达：(1)体外构建重组分泌性表达载体：A、人工合成的不带原始信号序列的hIL-10重组到整合型表达载体pPIC9K多克隆位点或将带有原始信号序列的hIL-10重组到整合型表达载体pPIC3.5K的多克隆位点；或，B、将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10和α—因子连接而成的融合基因以及带有原始信号序列的hIL-10重组到载体pA0815的EcoR I位点，利用Bgl II和BamH I内切酶在pA0815上体外构建多拷贝表达盒；或，(2)体外构建重组胞内可溶性表达载体：A、将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10 5’端加上起始密码子ATG，重组到载体pPIC3.5K的多克隆位点；或，B、将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10 5’端加上起始密码子ATG，重组到载体pA0815的EcoR I位点，利用Bgl II和BamH I内切酶在pA0815上体外构建多拷贝表达盒；3)毕赤酵母的转化：将重组表达载体用限制性内切酶Sal I或Sac I酶切成线性质粒，通过电穿孔或原生质体法转化毕赤酵母；4)毕赤酵母表达hIL-10：在毕赤酵母培养基中加入甲醇进行诱导表达hIL-10。