以花生种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的花生遗传转化方法，该方法以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体，经过预培养脱分化后，采用农杆菌介导的方法进行遗传转化。并通过优化芽诱导培养和生根培养过程，有效提高了转化再生率和生根速度。本发明不依赖于基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验载体材料，仅需一个超浮工作台以及相关农杆菌菌株就能在最简单地实验环境下实现花生成熟种子胚的休眠芽胚轴外植体的高效转化，而且周期短，在不同基因型品种间的转化效果稳定。

主权项

1、一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)转化外植体分离：消毒后的花生种子浸泡后，在无菌环境中除去花生种子皮，沿子叶间缝隙切开种子，将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体；将上述休眠芽胚轴外植体在预培养基上于24～28℃预培养0.5～1天，得到预培养后的休眠芽胚轴外植体；(2)侵染液制备：将含待转化质粒的农杆菌菌株接种至YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌菌体，并重悬于预冷至4℃的含有100mMol/L乙酰丁香酮的液体MS培养基中，使农杆菌重悬液的浓度在OD600＝0.2～1.5，即得到含有农杆菌的液体MS培养基；(3)转化：将预培养后的休眠芽胚轴外植体浸浮在上述含有农杆菌的液体MS培养基中，使农杆菌与休眠芽胚轴外植体充分接触5～30分钟进行转化后，取出休眠芽胚轴外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基于24～28℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养2～4天，得到共培养后的休眠芽胚轴外植体；(4)芽诱导培养：将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基上诱导丛生芽；(5)筛选培养：将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2～3次，得到筛选培养的丛生芽；(6)生根培养：将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基，在生根培养基上生长2～4周，代根长至4～12厘米长，得到生根的植株；(7)移植：将步骤(6)中生根的植株移至湿度为70～85％的灭菌砂土中，培养驯化后；便可将其移入温室生长、开花、结实；所述预培养基组成为：固体MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤；所述共培养培养基组成为：MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+100uM乙酰丁香酮；所述芽诱导培养基组成为：MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素；所述筛选培养基组成为：MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素；所述生根培养基组成为：1/2MS+3mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸。