MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法

摘要

一种MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法，构建重组质粒，设计合成引物和Taqman-MGB探针，进行二重荧光定量PCR，将大肠杆菌O157的rfbE、vt2的一段保守序列进行PCR扩增，获得目的片断，再将目的片断与PMD 18-T Vector连接，得到重组质粒，将重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，获得高浓度的质粒，将此高浓度质粒作10倍比稀释，作为标准样品，将标准样品和待测样品共同作二重荧光定量PCR，标准样品形成标准曲线，根据标准曲线可计算出待检样品中大肠杆菌O157的含量。本发明使用MGB探针，具有更高的敏感性和特异性，能快速、准确地检测样本中的大肠杆菌O157含量，可同时检测大肠杆菌O157的两个特异性毒力基因，是一种快速、准确的大肠杆菌O157检测方法。

主权项

1、一种MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征在于，设计合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探针，分别用rfbE、vt2引物进行PCR扩增，获得两个目的片断，将目的片断分别与PMD 18-T Vector连接，得到重组质粒，将重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，提取高浓度的重组质粒，将此高浓度质粒作10倍比稀释，作为标准样品，将标准样品和待测样品共同作二重荧光定量PCR，标准样品形成标准曲线，根据标准曲线计算出待检样品中大肠杆菌0157的含量；所述的引物，是指其序列为：rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cattgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta；所述的Taqman-MGB探针，是指其序列为：rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记Taqman-MGB基团vt2探针的5′端标记ViC荧光报告基团，3′端标记Taqman-MGB基团。