一种检测真菌多糖的方法

摘要

本发明公开了一种检测真菌多糖的方法，该方法是单相色谱技术为核心，并与MALS，高灵敏示差法及DLS进行有机组合构成的一种既可在线、又可离线，既可定量检测，又可对多糖的绝对分子量；分散度；分子构象；溶解性和稳定性等特性进行表征及分析。该方法包括制样、流动相的制备、进样、缓冲、聚焦平衡、洗脱分离和检测等步骤。与现有的苯酚-硫酸、凝胶电泳、HPLC等法相比，本发明具有以下特点：集定量与定性于一体；不破坏样品，全物理检测；样品吸附极少；操作程序简便、迅速，条件温和；无需标样即可获得多糖的绝对分子量及其分布；灵敏度高，可达10^-9；可同时检测多糖的多种物理化学特性。可广泛用于多糖及其它相关化合物的分析检测、质量控制及研发。

主权项

1. 一种检测真菌多糖的方法，包括以下工艺步骤：(1)制样称取10-100mg的真菌多糖样品置于干净的试管或小量杯中，加入5-60ml蒸馏水或0.85％氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(7.0mmol/L KH2PO4，7.0mmol/LNa2HPO4，pH＝6.8)搅拌使其溶解后，于4℃低温冰箱中保存备用，样品液的浓度为0.1-0.98mg/ml；(2)流动相的制备将上述用于溶解多糖的溶剂用脱气机进行脱气处理后作为流动相；(3)进样、缓冲、聚焦平衡将单相色谱(非对称场流分离)仪(The Eclipse AF4)、多角度静态光散射仪(MALS，DAWN HELEOS II)、动态光散射仪(DLS，DynaPro Titan)、示差折光检测器(RI，OPTILAB rEX)、脱气机(1100Series vacuum degasser)和进样泵等进行有效连接整合成一个完整的系统，以该系统为基础来实施本检测真菌多糖的方法；工艺操作条件：用微量移液器吸取上述已制备好的多糖样品5-120μL及适量的流动相进行进样、缓冲与聚焦平衡，进样、缓冲、聚焦平衡时间为5-10min，进样速度：0.05-0.95mL/min，聚焦平衡时间为1-5min；流道流速：0.2-2mL/min，交叉流流速：起始以2-9mL/min运行1-5分钟，然后降至1-4mL/min运行3-8分钟后逐渐降低至0ml/min，总运行时间为10-60分钟；操作方式为先调节流道流和交叉流的流动相的流速，待平衡稳定后再开始进样，糖样的流速为：0.05-0.95mL/min；(4)洗脱分离用上述制备的流动相溶液做洗脱剂，在上述样品进样、缓冲与聚焦平衡完成后开始洗脱5-49分钟；(5)检测检测手段采用在线或离线两种检测，在线检测是指自洗脱开始至洗脱结束的全程检测；而离线检测则是指洗脱完毕后的全部检测。