发明名称 |
一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法 |
摘要 |
本发明涉及一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法,包括以下步骤:(1)PCR模板DNA提取:(1.1)待测样品DNA提取:取1ml待测样品进行DNA提取,1ml待测样品-12000rpm,2min,弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml),37℃水浴30min-按照UNIQ-10DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K,55℃水浴30min-后参照UNIQ-10DNA提取试剂盒说明书提取DNA;(1.2)菌液DNA提取;(2)hly与ipaH质粒标准品的构建:(3)荧光定量PCR扩增及分析。本发明的有益效果:本发明运用双重荧光定量PCR(TaqMan探针)同步定量检测单增李斯特菌hly基因和志贺氏菌ipaH基因,为食品卫生行业提供一种特异、快速、定量准确的同步定量检测单增李斯特菌和志贺氏菌的方法。 |
申请公布号 |
CN101434992A |
申请公布日期 |
2009.05.20 |
申请号 |
CN200810121427.1 |
申请日期 |
2008.09.28 |
申请人 |
中国计量学院;李素芳 |
发明人 |
李素芳;徐 伟;刘 军 |
分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I |
主分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I |
代理机构 |
杭州九洲专利事务所有限公司 |
代理人 |
陈继亮 |
主权项 |
1、一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法,其特征在于:包括以下步骤:(1. 1)、PCR模板DNA提取:(1. 1.1)、待测样品DNA提取:取1ml待测样品进行DNA提取,取其中4个稀释度的0.1ml菌液涂布BHI平板,于37℃培养24h,进行菌落记数;1ml待测样品-12000rpm,2min,弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml),37℃水浴30min-按照UNIQ-10 DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K,55℃水浴30min-后参照UNIQ-10 DNA提取试剂盒说明书提取DNA;(1. 1.2)、菌液DNA提取:取过夜培养的菌液,采用UNIQ-10DNA提取试剂盒提取;(1. 2)、hly与ipaH质粒标准品的构建:(1. 3)、荧光定量PCR扩增及分析:将已经计算出原始拷贝数的单增李斯特菌与志贺氏菌质粒DNA,按10倍梯度稀释,取数量级105copies/μl到101copies/μl作为模板加入25μl反应体系,在IQTM5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增,得到标准曲线;其中PCR扩增反应体系(25μl):模板DNA各1μl;2×Premix ExTaqTM12.5μl;10μmol/L引物各1μl;10μmol/L探针各0.5μl;加灭菌超纯水至25μl,反应条件:95℃ 3min;95℃ 15s;58.5℃ 1min,45个循环。 |
地址 |
310018浙江省杭州市下沙高教园区学源街 |