切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：a)使扩增引物与核酸靶分子杂交；b)用DNA聚合酶合成双链核酸；c)所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口；d)DNA聚合酶以切口为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，并将旧链剥离以作为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点；和e)重复进行切割、延伸和剥离的步骤，以扩增出靶核酸序列。本发明还公开了利用海藻糖提高切口酶反应温度使其能够与热稳定DNA聚合酶配合使用的方法。本发明还公开了用于扩增靶核酸序列的试剂盒及试剂盒在检测传染病病原体中的用途。利用本发明可制成操作简单，低成本，便携式的仪器，从而普及核酸诊断试剂。

主权项

1、利用切口酶扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：1)使双链核酸靶分子变性，使第一正向引物(F1)，第二正向引物(F2)与核酸靶分子负链杂交，其中所述第二正向引物(F2)的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二正向引物(F2)的浓度应高于第一正向引物(F1)的浓度；使第一反向引物(R1)，第二反向引物(R2)与核酸靶分子正链杂交，其中所述第二反向引物(R2)的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二反向引物(R2)的浓度应高于第一反向引物(R1)的浓度；此后负链和正链进行相同的扩增步骤；2)DNA聚合酶延长第二正向引物(F2)；3)DNA聚合酶延长第一正向引物(F1)，同时剥离第二正向引物(F2)的延长链；4)第一反向引物(R1)，第二反向引物(R2)与步骤3)的正链产物(4)杂交，DNA聚合酶延长第二反向引物(R2)；5)DNA聚合酶延长第一反向引物(R1)，同时剥离第二反向引物(R2)的延长链，本步骤的产物(6)为两端固定的负链；本步骤的第一反向引物(R1)的延长产物(12)为双链DNA；6)第二正向引物(F2)与产物(6)负链杂交，DNA聚合酶延长第二正向引物(F2)；7)恢复DNA双链结构；在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链，此步骤产生的产物(9)为正链和负链DNA的混合物；步骤5)的延长产物(12)经步骤12)-14)产生产物(8)，重回步骤8)以后的扩增过程；8)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物(F2)和第二反向引物(R2)；9)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；10)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物(F2)和第第二反向引物(R2)；和11)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物(10)相同，因此可重新进入步骤9)-步骤11)的反应，重复进行切割、延伸和剥离的步骤，形成循环扩增。