水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法

摘要

一种水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法，是由提取标本DNA、PCR反应、ELISA反应和结果检测四个步骤实现的。本发明通过提供副溶血弧菌tlh、tdh两组特异性的地高辛标记引物、区分两个基因的生物素标记的探针以及用于定量的含有tlh基因特定序列的质粒，进而对水产品中副溶血弧菌进行检测。本发明可在96孔酶标板中进行，所提供的方法成本低廉、特异性好、灵敏度高，适用于对副溶血弧菌进行大规模、高通量的检测。

主权项

1、一种水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法，包括DNA模板的制备、PCR反应、特异探针进行ELISA反应和结果的检测，其特征在于：(1)、DNA模板的制备：a、待测标本无菌操作：贝类取含内脏的全部贝肉、鱼类取鱼体不同部位、甲壳类取包括鰓及肠的部分或整体；称取待测标本25g，加入3.5％无菌NaCl溶液225mL，均质后，取10mL加入90mLNaCl浓度3.5％的改进碱性蛋白胨水中。置于37℃恒温培养箱，120r/min增菌培养7h；b、取1. 0mL增菌后的细菌培养物，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液，加入100μL无菌水，漩涡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴2min，12000r/min离心5min，取上清；(2)、PCR反应：a、配制30μL反应体系：包括PCR Buffer3μL其中含有200mM pH8.4Tris-HCl、200mM KCl、100mM硫酸铵和15mM MgCl2，2.5mM dNTP 2.5μL，地高辛标记的正向引物TLH-F浓度10μM 1.5μL，地高辛标记的正向引物TDH-F浓度10μM 1.5μL，反向引物TLH-R浓度10μM 1.5μL，反向引物TDH-R浓度10μM 1.5μL，Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，加超纯水补足30μL，其中两对引物的靶基因分别为副溶血弧菌的tlh基因和tdh基因；b、混匀反应体系，PCR反应程序如下：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，共25个循环；循环结束后72℃延伸10min，冷却至4℃备用；(3)、特异探针进行ELISA反应：a、在96孔酶标板中每孔加200μL终浓度为1mg/L的链亲和素溶液，4℃过夜。取出后弃去孔中的液体，每孔加200μL pH7.4的PBS缓冲液，洗涤4次，每次都甩干；b、取PCR反应产物5μL于2个新的离心管中，一管加入5μL浓度10μM生物素标记的探针TLH-probe，另一管加入5μL浓度10μM生物素标记的探针TDH-probe，混合均匀。放入PCR仪中，94℃变性10min，56℃退火7min，各管中迅速加入200μL pH7.4的PBS缓冲液；c、取200μL上述反应液加入到包被好的96孔酶标板中，37℃温浴30min，用PBST溶液洗涤4次，每次都甩干，其中PBST溶液为含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液；