一种制备猪α-干扰素的方法

摘要

本发明提供一种制备猪α-干扰素的方法，通过目的基因克隆、构建芽孢杆菌表达载体、克隆启动子和信号肽序列并研究其对外源基因表达和分泌的影响，从而构建高效分泌型芽孢杆菌表达系统。通过改进猪α-干扰素基因工程菌发酵条件，提高其表达量；在复性液中添加与盐酸胍有相似结构的精氨酸，促进蛋白质溶解，不影响蛋白质活性，来提高猪α-干扰素的比活性，从而生产出具有高效、价廉、安全、无潜在病毒污染、稳定性高、单位体积活性效价高等优点的猪α-干扰素，本发明设计合理，适于工业化生产。

主权项

1. 一种制备猪α-干扰素的方法，通过以下技术方案实现：(1)设计一对在大肠杆菌中表达猪α-干扰素成熟肽基因的表达引物，在上、下游引物的5’端分别引入EcoRI和NotI酶切位点序列；(2)载体构建：将重组质粒和表达载体用EcoI和Xba I进行双酶切，回收酶切片段，与表达载体连接，转化，筛选阳性质粒，然后进行PCR和酶切鉴定；(3)猪α-干扰素在枯草芽孢杆菌中的表达：制备芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒经过点击转化导入其中，作进一步培养，并抽提质粒后进行SalI和XbaI双酶切检验；(4)重组工程菌的蛋白电泳：菌液上清进行浓缩，用银染对SDS-PAGE进行染色；(5)猪α-干扰素标的产物产量和活性的研究；(6)菌种制备：将猪α-干扰素基因工程菌菌株接种到含氨苄青霉素钠的LB液体培养基中培养，将菌液接种于发酵罐中，温度30℃，pH为7.0，搅拌速度200-220rpm，培养6小时后增温至45℃诱导，猪α-干扰素开始表达，至28小时表达量达到最大值，在此期间质粒稳定性良好；(7)获得产品：离心收集菌体，用缓冲液冲洗菌体，冰浴超声破碎，取上清液，收集包涵体沉淀，用洗涤液洗涤，取上清液，加入复性液，调节pH用复性液透析，取上清液浓缩；(8)产品纯化：利用DEAE阴离子交换纤维柱梯度洗脱，收集含猪α-干扰素的洗脱液，超滤浓缩，得到产品。