采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法

摘要

本发明涉及一种采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，利用核糖核酸酶H分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链的特性，根据含有1个或以上核糖核苷酸的核酸链水解情况确定被检测目标分子DNA的特性和含量。首先针对要检测的核酸分子序列设计嵌合分子信标，其环区域核苷酸序列与被测序列互补配对，且中间含有1个或几个核糖核苷酸。针对单链DNA，双链DNA，RNA等不同种类的被测样品，制备单链DNA以用作检测模板，将待检测样品放入核酸酶H反应混合液中混合，置于荧光检测仪于37℃温浴，实时检测反应溶液的荧光强度，根据荧光值可以指示被检测核酸分子的含量及其特性。

主权项

1、一种采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，其特征在于包括如下步骤：1)分子信标的设计和合成：根据被检测核酸分子的序列设计嵌合分子信标，分子信标的环区域的核苷酸序列能够与被检测核酸的序列互补配对，其序列中间有1个或几个核糖核苷酸；分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，且分子信标的茎结构中5—9对序列为互补配对；2)被检测DNA样品的制备：针对不同种类的被测样品制备检测模板，若被检测样品是单链DNA，则直接用于检测；若被检测样品是双链DNA，则采用变性方法使双链DNA解链成单链DNA；若被检测样品是RNA，则先用反转录酶将RNA分子反转录成单链cDNA，再将单链cDNA除去RNA后进行检测或直接将单链cDNA用于检测；3)核糖核酸酶H酶切反应：在100微升含有10ul1x核糖核酸酶H缓冲液的反应混合液中，加入100皮摩尔量的分子信标，再加入3—5微升被检测的单链DNA分子，混合后置于荧光检测仪，于37℃温浴20分钟～3小时，实时检测反应溶液的荧光强度，每隔2—3分钟读荧光值一次；其中所述1x核糖核酸酶H缓冲液的组分为：10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β一巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH8.0；4)荧光数值分析：根据荧光数值与被检测核酸分子含量的线性关系，得到被检测样品的核酸分子含量；并且针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性而进行定性分析。