圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法

摘要

一种圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别检测方法，它的方法是鳍条DNA的提取、基因组DNA的AFLP分析、性别特异AFLP标记的筛选及其序列，以及遗传性别鉴定方法的建立。本发明建立了圆斑星鲽鳍条DNA提取方法和AFLP分析技术，筛选出分子量分别为533bp和218bp的2个雌性特异AFLP分子标记，获得了这2个AFLP标记的核苷酸序列，创建了圆斑星鲽遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明首次筛选到圆斑星鲽雌性特异AFLP分子标记，建立了圆斑星鲽遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明方法具有先进、准确、可靠的特点，在圆斑星鲽性别控制和全雌苗种生产中具有重要应用价值，同时在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。

主权项

1、一种圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法及其序列，其特征在于它技术内容如下：1)、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选；2)、圆斑星鲽性别特异分子标记克隆及其序列；1)、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法，包括：(1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取；(2)、基因组DNA的AFLP分析；(3)、性别特异分子标记的筛选：(1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取：剪取重约10mg鳍条置于600μl裂解液中匀浆，加终浓度为18-22mg/ml的蛋白酶K和终浓度为95-105μg/ml的RNaseA，于55℃水浴消化至澄清；加入600μl的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1混合物抽提，充分混匀后离心12000rpm，10min；吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用；所述的裂解液组成为10mM Tris-HCl，pH8.0；100mM EDTA，pH8.0；100mM NaCl；0.5％SDS；所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD260/OD280值为1.76-1.80；(2)、基因组DNA的AFLP分析：基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤：第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析；所述的对DNA模板进行酶切，其方法是：先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶；所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是：向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4DNA连接酶，20℃孵育20小时；所述的预扩增，其方法是：将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增；所述的选择性扩增：其方法是：将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的EcoRI引物和MseI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的变性剂，于94℃变性5分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；所述的电泳分析，其方法是：将变性好的扩增产物用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；