一种骨胶原凝胶液的制备方法

摘要

本发明涉及生物医学工程领域，是一种为进行双相接种法构建组织工程骨而制备骨胶原的方法，特别是一种骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于采用如下的制备工艺步骤：1)脱钙骨基质粉的制备；2)脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除；3)去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性；4)胶原蛋白变性后的脱钙骨基质的胶原蛋白酶解；5)胶原蛋白纯化；6)凝胶液制备。本发明具有操作简单，提取效率高，胶原纯度高，成凝胶性好的优点。

主权项

1、一种骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于采用如下的制备工艺步骤：1)脱钙骨基质粉的制备；2)脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除；3)去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性；4)胶原蛋白变性后的脱钙骨基质粉的胶原蛋白酶解；5)酶解后的胶原蛋白的纯化；6)骨胶原蛋白凝胶液制备；前述的脱钙骨基质粉的制备是取新鲜动物长骨，去除周围软组织及骨膜、骨端松质骨，刮除骨髓，然后将皮质骨劈成碎块，经清水冲冼后，加入1∶1的甲醇-氯仿脱脂12-72小时，再加入摩尔浓度为0.1-1.0M的盐酸脱钙3-14天，经三蒸水漂洗后，再次经1∶1的甲醇-氯仿脱脂12-72小时，经组织粉碎机将已软化的皮质骨块搅碎成脱钙骨基质粉，风干备用；前述的脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除是取5份脱钙骨基质粉，加入150-250份浓度为0.01％-0.2％的NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用12-72小时，然后取出过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤；前述的去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性是将去除非胶原杂质处理后的脱钙骨基质粉加入50-100份pH值为7.4的、含有摩尔浓度为2.0-6.0M盐酸胍的Tris-HCl溶液中，置于4℃冰箱中作用12-72小时，然后取出过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤去除盐酸胍；前述的胶原蛋白变性后的脱钙骨基质粉的胶原蛋白酶解是将经胶原蛋白变性后的脱钙骨基质粉加入200份-800份摩尔浓度为0.1-1.0M的醋酸溶液中，再加入0.05-2份胃蛋白酶，置于磁力搅拌器上，在5℃-25℃环境中连续搅拌24-96小时，获得脱钙骨基质液；前述的酶解后的胶原蛋白的纯化是将经过胶原蛋白酶解后得到的脱钙骨基质液在2-10℃温度下，在转速为6000-20000rpm的离心机上离心10-60分钟后，取其上清液，在上清液中加入NaCl晶体，使上清液中NaCl浓度达2M，在有大量絮状沉淀产生时，再次在前述相同条件下离心，取沉淀物，加入100-200份摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶解并装入透析袋，将透析袋放入摩尔浓度为10-20mM的Na2HPO4溶液中透析2-24小时灭活胃蛋白酶，再将透析袋放入摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶液中透析24-72小时后，再重复上述盐析、离心、溶解、透析操作一次，获得的粘性胶原凝胶液装入烧杯中冻干，取得纯化的冻干骨胶原；前述骨胶原蛋白凝胶液制备是将冻干骨胶原用摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶解，制成浓度为0.1-10％的骨胶原凝胶液。