共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6，将重组质粒转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT-PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS-PAGE和Western blot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP5蛋白及M蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

主权项

1.共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗的制备方法，其特征在于通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF5及ORF6的全基因序列，并将PRRSV SD1株的完整ORF5及ORF6插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒pIRES-ORF5及ORF6双基因核酸疫苗；该共表达PRRSV ORF5及ORF6双基因核酸疫苗是通过以下方法构建而成：1)ORF5及ORF6的扩增：根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF5及ORF6的引物，引物序列如下：P5s：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’P5r：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’扩增702bp；P6s：5’-AGCTAGCCGCCACCATGGGGTCGTCC-3’P6r：5’-AGAATTCTGGCACCAGCTGATTGACTGG-3’扩增607bp；以SD1株的cDNA为模板，通过引物P5s及P5r扩增ORF5，通过P6s及P6r扩增ORF6基因；2)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的构建：将ORF6的PCR产物和pIRES质粒经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF6插入pIRES，构建pIRES-ORF6重组质粒；再将ORF5的PCR片段与pIRES-ORF6重组质粒经Xba I和Not I双酶切，将ORF5插入pIRES-ORF6，构建pIRES-ORF5及ORF6重组质粒；3)pIRES-ORF5及ORF6真核重组表达载体的转染：将重组质粒pIRES-ORF5及ORF6转染CHO细胞，建立稳定表达的细胞系，通过RT-PCR方法检测到PRRSV ORF5及ORF6基因的转录，通过SDS-PAGE和Westernblot检测到GP5及M蛋白的表达和免疫活性，并通过间接免疫荧光检测到转染质粒的CHO细胞内有PRRSV特异性的蛋白表达。