N-糖基化基因工程改造毕赤酵母

摘要

本发明提供了一种将毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，除去酵母本身的糖基化旁路，同时将人源化糖基通路的基因导入到该细胞株，使其表达的糖蛋白具有哺乳动物细胞来源的特性，可直接用于人体。本发明可高效、简便、低成本地获得能表达完整人源化糖苷链的酵母细胞株，对一些具有潜在临床价值的糖蛋白进行表达和纯化的研究以及产业化研究。

主权项

1. 一种对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，它包括步骤：a. 设计OCH1引物，用PCR方法，获得毕赤酵母的OCH1基因序列，在OCH1序列ORF靠近5’端引入2个终止子，重组到pPICZB质粒中，该质粒转染到GS115细胞内，获得OCH1基因失活的重组子。b. 用PCR方法，获得T.reesei 1，2-mannosidase的基因序列和酵母HDEL基因序列，并将此二序列按开放阅读框保持不变的方式拼接后，重组到pGAPZαA质粒内，将此质粒转染到上述重组子，获得二级重组子M5。c. 用PCR方法，从人细胞中获得GnTI序列，从酿酒酵母中获得α-mannosyltransferase Kre2p序列，将Kre2p的N-端穿膜序列与GnTI催化区域序列拼接后装入到pPIC9中，再转染毕赤酵母细胞株。