切割来自着色性干皮病基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其应用

摘要

一种I-CreI变体，其具有至少两种置换，所述两种置换各自位于I-CreI上第26～40和44～77位的LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中，所述变体能够切割来自着色性干皮病基因的DNA靶序列。所述变体和衍生产物用于预防和治疗所述着色性干皮病的用途。

主权项

1. 一种I-CreI变体，其特征在于，其具有至少两种置换，分别位于I-CreI第26～40位和第44～77位的LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中，所述变体能够切割来自着色性干皮病基因的DNA靶序列，并且可通过至少包含下述步骤的方法获得：(a)构造第一系列的I-CreI变体，该第一系列具有至少一种位于I-CreI第26～40位的LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中的置换，(b)构造第二系列的I-CreI变体，该第二系列具有至少一种位于I-CreI第44～77位的LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中的置换，(c)挑选和/或筛选来自步骤(a)的第一系列变体，其能够切割突变体I-CreI位点，其中(i)在所述I-CreI位点中第-10～-8位的核苷酸三联体已经替换为存在于着色性干皮病基因上的基因组DNA标靶第-10～-8位的核苷酸三联体，并且(ii)第+8～+10位的核苷酸三联体已经替换为存在于所述基因组标靶中第-10～-8位的核苷酸三联体反向互补序列，(d)挑选和/或筛选来自步骤(b)的第二系列变体，其能够切割突变体I-CreI位点，其中(i)在所述I-CreI位点第-5～-3位的核苷酸三联体已经替换为存在于步骤(c)中的所述基因组标靶中第-5～-3位的核苷酸三联体，并且(ii)第+3～+5位的核苷酸三联体已经替换为存在于所述基因组标靶中第-5～-3位的核苷酸三联体反向互补序列，(e)挑选和/或筛选来自步骤(a)的第一系列变体，其能够切割突变体I-CreI位点，其中(i)所述I-CreI位点第+8～+10位的核苷酸三联体已经替换为存在于步骤(c)中的所述基因组标靶中第+8～+10位的核苷酸三联体，并且(ii)第-10～-8位的核苷酸三联体已经替换为存在于所述基因组标靶中第+8～+10位的核苷酸三联体反向互补序列，(f)挑选和/或筛选来自步骤(b)的第二系列变体，其能够切割突变体I-CreI位点，其中(i)所述I-CreI位点第+3～+5位的核苷酸三联体已经替换为存在于步骤(c)中的所述基因组标靶中第+3～+5位的核苷酸三联体，并且(ii)第-5～-3位的核苷酸三联体已经替换为存在于所述基因组标靶中第+3～+5位的核苷酸三联体反向互补序列，(g)在单个变体中组合来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体的第28～40位和第44～70位的突变，以得到一种新颖的可切割序列的同型二聚体I-CreI变体，其中(i)在第-10～-8位的核苷酸三联体与存在于步骤(c)中的所述基因组标靶中第-10～-8位的核苷酸三联体相同，(ii)第+8～+10位的核苷酸三联体与存在于所述基因组标靶中第-10～-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)第-5～-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因组标靶中第-5～-3位的核苷酸三联体相同，并且(iv)第+3～+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组标靶中第-5～-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(h)在单个变体中组合来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体的第28～40位和第44～70位的突变，以得到一种新颖的可切割序列的同型二聚体I-CreI变体，其中(i)在第+3～+5位的核苷酸三联体与存在于步骤(c)中的所述基因组标靶中第+3～+5位的核苷酸三联体相同，(ii)在第-5～-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因组标靶中第+3～+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)所述I-CreI位点的第+8～+10位的核苷酸三联体已经替换为存在于所述基因组标靶中第+8～+10位的核苷酸三联体，并且(iv)在第-10～-8位的核苷酸三联体与所述基因组标靶中第+8～+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(i)组合所述步骤(g)和(h)中得到的变体，形成异二聚体，以及(j)挑选和/或筛选来自步骤(i)、能够切割所述来自着色性干皮病基因的DNA靶序列的异二聚体。