一种简便高效构建重组杆状病毒的方法

摘要

本发明是一种简便高效构建重组杆状病毒的方法。主要步骤如下：(1)构建含双启动子，能定向快速克隆PCR产物的供体质粒；(2)将I－SceI表达盒引入到E.coliDH10B的基因组中，同时将2个I－SceI位点和一个抗性基因引入杆状病毒Bacmid，并且将能表达Red－Gam重组酶的质粒转化进E.coliDH10B中，构建新的受体菌株CTRDH10B/Bacmid/pML104；(3)将重组供体质粒导入CTRDH10B/Bacmid/pML104中，诱导I－SceI内切酶和Red－Gam重组酶表达，在细菌内同源重组获得重组Bacmid；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞并进行分析。本发明无须复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，做到真正高效、快速、方便，特别适合构建高质量库容量大的杆状病毒cDNA文库。

主权项

1.一种简便高效构建重组杆状病毒的方法，其特征在于：该构建方法按下列步骤进行：(1)构建含双启动子，能定向快速克隆PCR产物的供体质粒；(2)将阿拉伯糖启动子(pBAD)控制的I-SceI表达盒重组到大肠杆菌E.coliDH10B的基因组中，同时将2个I-SceI位点和一个抗性基因引入杆状病毒Bacmid，并且将能由IPTG诱导表达Red-Gam重组酶的质粒转化进E.coliDH10B中，构建出新的受体菌株CTRDH10B/Bacmid/pML104；(3)将携带外源基因的供体质粒导入含Bacmid的受体细菌中，然后经阿拉伯糖诱导归位酶I-SceI的表达，I-SceI酶在受体菌内切割供体质粒和受体Bacmid，使其线性化以提高同源重组效率和降低亲本Bacmid背景，最后经IPTG诱导表达Red-Gam重组酶，在细菌内同源重组获得重组Bacmid；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA，转染昆虫细胞，3～5天后收获重组病毒粒子和进行蛋白表达和纯化分析。