测定食品中苏丹红1号的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法

摘要

本发明公开了测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是合成苏丹红1号的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过杂交瘤技术包括免疫、融合、筛选等步骤获得抗苏丹红1号的单克隆抗体。该抗体用于苏丹红1号的免疫分析，标准曲线的浓度范围为0.1～100ng/mL，IC₅₀为1.1～2.0ng/mL；抗体与苏丹红2－4号的交叉反应率为0.95～33.9％，与其他6种食品可添加色素几乎没有交叉反应；说明所建立的ELISA不仅灵敏度高而且特异性强。6种市售食品加标后用甲醇萃取，萃取液经适当稀释用ELISA测定，苏丹红1号的加标回收率为88.2～110.5％，相对标准偏差为1.5～17.4％。用HPLC和ELISA对9种加标样品进行分析，两种方法相关性较好(r＝0.9840，n＝9)。

主权项

1.测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)苏丹红1号修饰物的制备步骤1：将0.02～0.08mol丙二酸溶于20～80mL新蒸吡啶中，加入0.02～0.1mol对硝基肉桂酸和0.001～0.004mol醋酸胺，此混合物在温度100～150℃回流1～7小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到步骤1产物4～10g，熔程：275～280℃；步骤2：将步骤1产物0.15～0.65g，5～35mg钯碳，2～15mL甲醇加入反应釜中，通入氢气，于温度100～120℃反应1～5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，用二氯甲烷∶甲醇＝5∶1的体积比过柱，收集TLC板实验中Rf值为0.3的产物，旋干溶液，得到乳白色固体；步骤3：将步骤2产物0.1g溶解在1.5～2.5mL浓盐酸中，在温度5～10℃加入含0.01～0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5mL，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将0.04～0.12g 2-萘酚溶解于8～12％的氢氧化钠水溶液3～5mL中，冷却至5℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到0.12～0.30g苏丹红1号-3-丙酸，简写为Sudan 1-C3，其反应式如下：(2)免疫原和包被抗原的制备将0.10～0.45mmol的Sudan 1-C3，0.10～0.80mmol的二环己基碳二亚胺，0.10～0.80mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于100～600μL的二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，将混合物离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白或卵清蛋白，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，其中，Sudan 1-C3-牛血清白蛋白为免疫原，Sudan 1-C3-卵清蛋白为包被抗原；(3)苏丹红1号单克隆抗体的制备免疫：将免疫原溶解于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50～100μg，第一次免疫后，每隔两周再次免疫，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测鼠的抗血清效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；融合：最后一次对小鼠加强免疫，三天后取脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1～10∶1的比例混合，在50％聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于温度37℃，5％CO₂培养箱中培养；筛选：融合后2周，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测；单克隆抗体的大量生产：先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油1∶1混合并置于温度-20℃保存；(4)建立测定苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定食品中苏丹红1号含量的ELISA；(5)溶剂效应选用常用的萃取溶剂甲醇和乙腈，测试了它们对ELISA的影响；用含0，1，2，5，10，20，30，40，50％的甲醇或乙腈水溶液，配置浓度为0.1～100ng/mL的苏丹红1号的标准溶液，进行ELISA操作过程并作出标准曲线；结果表明，10％以下的甲醇和30％以下的乙腈对ELISA的灵敏度影响较小；(6)ELISA对加标样品中苏丹红1号含量的测定随机选择了10种食品：辣椒面I，辣椒面II，辣椒酱I，辣椒酱II，番茄酱I，番茄酱II，火锅料I，火锅料II，香肠I，香肠II，经ELISA检测，辣椒酱II为阳性样品，苏丹红1号含量为1.03μg/g样品，其余样品中的苏丹红1号含量ELISA均无法测出，为阴性样品，最后选择6种样品即辣椒面I，辣椒酱I，辣椒酱II，番茄酱I，火锅料I和香肠I做加标实验，同一样品取两份，一份加入适量的苏丹红1号的甲醇溶液，一份加入等体积的甲醇，静置过夜，超声震荡30分钟，涡旋混合1分钟，静置后，取上层清液离心20分钟，上层清液用5％甲醇稀释后用ELISA直接测定，回收率在88.2-110.5％，相对标准偏差为1.5-17.4％，说明该方法的准确性和精密度都较好；(7)ELISA和HPLC的比较苏丹红1号的HPLC条件为：色谱条件：Hypersil Gold柱，柱温为室温，流动相为甲醇∶2％的乙酸水溶液＝90∶10，流量1mL/min，进样20μL，紫外检测波长：480nm，标准溶液的浓度为：0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，9种加标样品，即辣椒面I，加标浓度5μg/g和20μg/g；辣椒酱I，加标浓度2μg/g，10μg/g；辣椒酱II，加标浓度0μg/g，2μg/g；番茄酱I，加标浓度5μg/g；火锅料I，加标浓度10μg/g和香肠I，加标浓度5μg/g；加标样品用甲醇萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝0.8492X+0.3525，相关系数为0.9840，n＝9，说明二者的相关性很好。