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1、一种水产动物SNP标记筛选方法，其特征在于包括如下步骤：1)基因组DNA提取按照常规酚氯仿方法分别提取8-12个半滑舌鳎个体组织DNA，取少量组织放入研钵中，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末，将粉末转入离心管中并加入DNA提取液TENS，然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽提两次，向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-30分钟，70％乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA，测定DNA浓度后，将8-12个个体的DNA等量混合形成DNA池；2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增取1-2μg混合后的基因组总DNA，加入50-100单位内切酶MseI进行酶切反应，65℃温浴1.5-2.5小时，酶切产物经纯化后，用TE溶解，取部分纯化的酶切产物与序列为5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的MseI接头用T4连接酶16℃连接过夜，然后对连接产物进行PCR预扩增，用以富集DNA产物，PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5μL酶切-连接产物、终浓度为0.4μM、序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’的MseI-N引物、1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTP以及1U的Taq DNA聚合酶，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min进行20个循环，最后72℃延伸10min，反应产物用1％琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，PCR产物应该为一分步均匀的弥散带；3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸将预扩增产物进行变性及复性，使其形成杂交双链，变性及复性条件为95℃2min，在5秒内将其从温度95℃降到85℃，速度为-2℃/秒，然后从85℃降到25℃，速率为-0.1℃/秒，4℃保存，复性产物用CEL I对SNP位点进行酶切，酶切条件为：10μL复性产物与20μL反应缓冲液，10mM HEPES 7.5，10mM MgSO4，0.002％(w/v)TritonX-100，20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1单位CEL I酶，45℃温浴25-35分钟，加入5μL 0.15M EDTA，pH 8，终止反应；酶切产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于Bst延伸，延伸条件为：20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％吐温X-100，20nM dATP，20nM dGTP，20nM dCTP，13nM dTTP，7nMbiotin-dUTP，4单位Bst DNA聚合酶，然后置于65℃温浴1小时；4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离1-2mg的包被有链亲和素的磁珠用300μL TEN100溶液在室温下洗涤3次，然后将其与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35分钟，磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，首先进行3次非严谨性洗脱：使用400μL缓冲液TEN1000于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟；随后进行3次严谨性洗脱：使用400μL 0.2×SSC+0.1％SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清；最后再用1×SSC洗脱两次，除去SDS，加入50μL TE，吹打均匀，于95℃下水浴10分钟，期间不时搅动或者轻轻吹打均匀，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，经纯化后备用；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序将纯化后的5μL DNA液用于PCR扩增，条件与预扩增相同，PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后，按照常规方法让测序公司进行序列分析；6)SNP标记鉴定根据测序结果进行引物设计；将8-12个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增，克隆测序，每条序列需测序10个克隆，验证SNP位点，将单碱基差异出现频率在20％及以上的位点定义为SNP标记。 |
