多级放大荧光免疫分析方法

摘要

本发明属于荧光免疫分析技术领域，涉及多级放大荧光免疫分析方法。采用含16碳长链琥珀酰亚胺酯-生物素标记特异及发光蛋白(R-PE)，使R-PE分子与相结合的亲和素(A)之间的空间距离以及R-PE与固相微珠(PSMD)的距离加长，有效的解决了发光基团(R-PE)与多级结合的免疫复合物之间的“空间阻碍”，使R-PE发出的不被相邻的分子及固相材料所熄灭，保证了荧光强度的多级放大。实现了荧光强度10³以上的多级放大，使灵敏度达1pg/ml。可方便的应用于各类免疫分析，如RIA、ELISA、FIA等领域。

主权项

1.多级放大荧光免疫分析方法，其特征在于，步骤和条件如下：1、使用的仪器：·荧光分析仪Luminex Multi-100型；·高速离心机2000rpm；·超声波清洗仪50HZ；·蛋白、核酸监测仪；2、使用的试剂：·羧基化聚苯乙烯中80-100nm Luminex公司产；·硫代琥珀酰亚胺酯，碳二亚胺，生物素，链亲和素，R-藻红蛋白。皆为免疫纯，购自sigma试剂；·HBsAg，抗HBs，羊抗人IgG，免疫纯长春生物制品研究所产；·HCV抗原、HIV抗原、HBe抗原，中国医科院病毒所产；·Sephadex G-25、G-100，磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐等为分析纯；3、步骤和条件由以下4步组成：①.羧基化微珠偶联PcAb配制缓冲液：·活化缓冲液-0.1M磷酸盐缓冲液，其pH6.2；·偶联缓冲液-0.05M磷酸盐缓冲液，其pH7.4；·冲洗缓冲液-含体积比为0.1％吐温-20的0.05M的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；·贮存缓冲液-0.01M磷酸盐缓冲液，其pH7.2，含质量体积比为0.05％的硫柳汞，含体积比为0.05％的庆大霉素；偶联PcAb方法：·取羧基化聚苯乙烯1ml，其含微珠1.3×107个，用去离子水及活化缓冲液各冲洗两次；·加偶联活化剂-硫代琥珀酰亚胺酯和1-乙基-(3-二甲基、氨基、丙基)碳二亚胺分别溶于活化缓冲液浓度均为50mg/ml，各取10μl加到羧基化聚苯乙烯中，室温反应20分钟，用偶联缓冲液冲洗两次；·加入PcAb150μl其中含蛋白含量15μg，室温反应3小时，用冲洗缓冲液冲洗三次，之后将偶联抗-HBs的羧基化聚苯乙烯存放于贮存缓冲液中，4℃保存备用.②.B标记McAb·McAb，其MW150,000，溶于0.1M磷酸盐，其pH7.2含0.15M NaCl，质量体积浓度为10mg/ml；·取水溶性长链硫代琥珀酰亚胺-生物素溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml；取20ml，含8×104mM，加入1mlMcAb溶液中，其中，长链硫代琥珀酰亚胺-生物素与McAb的摩尔比为12∶1，室温反应60分钟；·用pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液平衡Sephadex-G-25柱层析，取集第一峰，加入体积比为0.05％的庆大霉素于4℃保存；③.B标记藻红蛋白R-PE·取0.5mlR-PE，含R-PE1mg置于透析袋中，透析液为0.05M硼酸盐缓冲液，其pH8.5，含0.3M NaCl，三次换液，每次500ml，在4℃放置24小时，取出置于反应管中；·取0.2mg长链硫代琥珀酰亚胺-生物素，其对R-PE摩尔比为1∶26，直接溶于R-PE中，室温反应90分钟，然后加入中止液0.5ml，中止液为0.075g甘氨酸溶于1ml 0.1M pH7.5的磷酸盐溶液；·Sephadex G-100经0.01M pH7.2的磷酸盐溶液平衡后，将反应液过柱，收集第一峰，加0.01％NaN3于4℃保存；④.进行荧光免疫分析HBsAg：·试剂准备：稀释液为0.01M，pH7.2的磷酸盐溶液，冲洗液：0.01M pH7.2磷酸盐溶液含0.15M NaCl，含体积比为0.01％的吐温-20；PcAb联接微珠 13×107个/ml；HBsAg 10mg/ml；B-McAb 90mg/ml；A 1mg/ml；B-R-PE 4mg/ml.分析方法：将已配好浓度的PcAb、HBsAb和B-McAb三种溶液混合，加入④中配好的稀释液300μL，室温下温育1-2个小时后，加冲洗液冲洗三次，为悬浮液1；将已配好浓度的A与B-PE溶液混合，加入④中配好的稀释液100μL，室温下温育30-60分钟后，加冲洗液冲洗三次，为溶液2；将悬浮液1和溶液2合并，室温下温育30-60分钟后，再加冲洗液冲洗三次，然后离心分离，分出沉淀物PSMD，对其用稀释液稀释至100μL，最后用荧光分析仪或激光荧光光度计进行测量，从而构成多级放大荧光免疫分析方法。