一种海水鱼类卵子电镜扫描样品制备方法

摘要

本发明提供一种海水鱼类卵子电镜扫描样品制备方法，该方法以磷酸盐缓冲液稀释的戊二醛固定液固定新鲜鱼卵，洗净后，用乙醇浓度梯度范围为20％-70％，以10％的梯度逐级升高和乙醇浓度梯度范围为75％-100％，以5％的浓度梯度逐级升高两阶段对卵子进行脱水处理，并在加有粉剂CaCl₂作为吸水剂的纯丙酮中脱水，再经临界点干燥和样品喷金，即制成海水鱼类卵子电镜扫描样品，样品中卵子完整率高达93.8％-96.7％。本发明的技术特点是方法简便、稳定、易操作，卵子完整率高、质量优，技术成本低。

主权项

1.一种海水鱼类卵子电镜扫描样品制备方法，其特征在于包括以下的制备步骤：(1)样品固定：用0.2M磷酸氢二钠溶液的母液A和0.2M磷酸二氢钠溶液的母液B按体积比为2～3∶1的比例混合再稀释配制成pH 7.2，0.1M的磷酸盐缓冲液PBS，再用该磷酸盐缓冲液PBS稀释戊二醛溶液，使戊二醛终浓度为2.0-3.0％，以此作为固定液，用该固定液固定由亲鱼经催熟和诱导而排出的新鲜鱼卵，固定12-36小时后更换一次固定液；(2)样品清洗：用玻璃吸管从固定液中移出卵子，用依上述方法配制的磷酸盐缓冲液PBS洗涤卵子5-7次，每次浸洗卵子15-25min，以清除固定液和卵子表面粘附的卵巢粘液及杂质；(3)样品脱水：洗净后的卵子进行乙醇梯度脱水处理，分两个阶段进行，第一阶段的乙醇浓度梯度范围为20％-70％，以10％的梯度逐级升高，每级次脱水10-15min，在用70％的乙醇溶液脱水后，保存于相同乙醇溶液中8-12hr；第二阶段的乙醇浓度梯度范围为75％-100％，以5％的浓度梯度逐级升高，其中在90％、95％和100％的三级乙醇浓度梯度分别脱水2次，每级次脱水15-20min，最后在加有粉剂CaCL2作为吸水剂的纯丙酮中脱水20min，粉剂CaCL2与丙酮的重量体积比为2克/100mL；(4)临界点干燥：经脱水处理后的卵子移入临界点干燥器中进行液态CO2临界点干燥2.5-3.5hr；(6)样品喷金：将经临界点干燥的卵子分布于粘贴有导电胶的金属样品台上，在离子喷涂仪上喷金，在卵子样品表面均匀镀上一层使卵子样品能够导电的金膜，完成喷金的卵子样品在扫描电子显微镜下观测。