| 主权项 |
1.一种内含一或多个与Lys12、Lys21和N中至少一者 共价结合之PEG单元(对每一个hGRF而言)之hGRF-PEG共 轭体之位置专一性制备方法,其包括在pH介于7与9 间之溶剂中,在溶液中进行hGRF与活性PEG间的共 轭反应,其中该溶剂系选自于高浓度菸硷醯胺水溶 液、去折叠剂(如尿素)之缓冲水溶液或选自二甲 基亚、二甲基甲醯胺/缓冲液或乙/缓冲液之 极性有机溶剂所组成之群组,然后由反应混合物中 分离并纯化出所欲之hGRF-PEG共轭体。 2.如申请专利范围第1项之方法,其中该溶液是菸硷 醯胺之浓缩水溶液或是一种去折叠剂(defolding agent )之缓冲水溶液。 3.如申请专利范围第1项之方法,其中该溶剂是一种 选自以下的极性有机溶剂:二甲基亚、二甲基甲 醛/缓冲溶液或乙/缓冲溶液。 4.如申请专利范围第1项之方法,其中该hGRF-PEG共轭 体系自反应混合物中分离出来并以色层分析法加 以纯化。 5.如申请专利范围第1-4项中任一项之方法,其中该 hGRF是h-GRF(1-29)-NH2。 6.如申请专利范围第1项之方法,其中在共轭反应发 生前,hGRF系在N、Lys12和Lys21等位置中的一或多 个位置受到保护。 7.如申请专利范围第1或6项之方法,其进而包括一 个在共轭反应后的去保护基团反应。 8.如申请专利范围第1-4和6项中任一项之方法,其中 该活性PEG是一种以单甲氧基化形式存在之烷化或 醯化的PEG。 9.如申请专利范围第5项之方法,其中该活性PEG是一 种以单甲氧基化形式存在之烷化或醯化的PEG。 10.如申请专利范围第7项之方法,其中该活性PEG是 一种以单甲氧基化形式存在之烷化或醯化的PEG。 11.如申请专利范围第1-4和6项中任一项之方法,其 中该共轭反应系于周围温度下进行。 12.如申请专利范围第5项之方法,其中该共轭反应 系于周围温度下进行。 13.如申请专利范围第7项之方法,其中该共轭反应 系于周围温度下进行。 14.如申请专利范围第8项之方法,其中该共轭反应 系于周围温度下进行。 15.如申请专利范围第9项之方法,其中该共轭反应 系于周围温度下进行。 16.如申请专利范围第10项之方法,其中该共轭反应 系于周围温度下进行。 17.一种根据申请专利范围第1项之方法所制备的内 含至少一个与Lys12、Lys21和N中至少一者共价结 合之PEG单元(对每一个hGRF而言)之hGRF-PEG共轭体。 18.如申请专利范围第17项之hGRF-PEG共轭体,其中1个 PEG单元系共价结合在Lys12上。 19.如申请专利范围第17项之hGRF-PEG共轭体,其中1个 PEG单元系共价结合在Lys21上。 20.如申请专利范围第17项之hGRF-PEG共轭体,其中在 Lys12和Lys21每一者上各共价结合1个PEG单元。 21.如申请专利范围第17项之hGRF-PEG共轭体,其中在 Lys12、Lys21和N之每一者上各共价结合1个PEG单元 。 22.一种[Lys(Alloc)12,21]-hGRF,其系申请专利范围第1项 之共轭反应的中间物。 23.一种[N-异丙基-Tyr1,Lys(Alloc)12]-hGRF,其系申请专 利范围第1项之共轭反应的中间物。 24.一种如申请专利范围第17至21项之hGRF-PEG共轭体 作为治疗、预防或诊断与生长激素相关疾病之药 物之用途。 25.如申请专利范围第24项之用途,其系用来制备一 种可治疗、预防或诊断与生长激素相关疾病的药 物。 26.如申请专利范围第25项之用途,其系用来制备一 种可治疗或诊断生长激素不足(GHD)的药物。 27.一种用于治疗、预防或诊断与生长激素相关疾 病之药学组成物,其包含申请专利范围第17至21项 中任一项所述之共轭体与一或多种药学上可接受 的载体和/或赋形剂。 图式简单说明: 图1显示hGRF(1-29)-NH2之胺基酸序列。箭头代表可能 发生聚乙二醇化反应的位置。 图2显示依实施例1所述方法在DMSO中进行之聚乙二 醇化反应中所得混合物之逆相-HPLC色层分析结果 。前两个主要波峰为每莫耳hGRF含1PEG链之共轭体 所造成的。接下来的小波峰为hGRF:2PEG共轭体所造 成的,最后一个小波峰为hGRF:3PEG共轭体所造成的。 图3a显示hGRF(1-29)及本发明PEG共轭体被枯草杆菌蛋 白降解的情形。 图3b显示hGRF(1-29)及本发明PEG共轭体被胰凝乳蛋白 降解的情形。 图4显示以环形二色法对[Lys(MPEG5,000-CH2-CO-Nle-CO)12, 21-hGRF(1-29)-NH2]所进行的光谱分析。该光谱可和"天 然"hGRF之光谱重叠。 图5显示各类hGRF-PEG共轭体(来自DMSO之第一次制备) 在CHO-hGRFR-LUC体外分析试验中之生物效用。数据为 三次独立试验的平均値。 图6显示各类hGRF-PEG共轭体(来自DMSO之第二次制备) 在CHO-hGRFR-LUC体外分析试验中之生物效用。数据为 两次独立试验的平均値。 图7显示各类hGRF-PEG共轭体(来自菸硷醯胺制备)在 CHO-hGRFR-LUC体外分析试验中之生物效用。数据为两 次独立试验的平均値。 图8显示各类hGRF-PEG共轭体(来自DMSO之第一次制备) 在由老鼠脑下垂体细胞释出GH之体外试验中之生 物效用。 图9显示各类hGRF-PEG共轭体(来自DMSO之第二次制备) 在由老鼠脑下垂体细胞释出GH之体外试验中之生 物效用。 图10显示雄鼠在静脉注射hGRF(400g/老鼠)后其血浆 中hGRF及血清中GH量的时间-反应曲线。每一个数据 点为9只老鼠之平均値+标准偏差。 图11A(参见该页第一个图形)显示雄鼠在静脉注射 400g/每只老鼠之hGRF-PEG共轭体(DMSO制备)后,其血 清中GH量的时间-反应曲线。每一个数据点为3只老 鼠之平均値。 图11B(参见该页第二个图形)显示雄鼠在静脉注射 400g/每只老鼠之hGRF-PEG共轭体(DMSO制备)后,其血 浆中hGRF量的时间-反应曲线。每一个数据点为3只 老鼠之平均値。 图12显示用来评估GRF活性之基因分析中pcDNA3-hGRF-R 质粒之限制图。 图13显示用来评估GRF活性之基因分析中pTF5-53LUC质 粒之限制图。 |
