采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法

摘要

本发明公开了一种采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法，属于一种可以替代活体动物(人体)皮肤用于毒理学试验的领域。它包括真皮支架制备、人成纤维细胞和角质细胞制备、真皮替代物制备、人工皮肤无血清专用培养基配制、器官型全层皮肤培养和人工皮肤毒性检验，制备的人工皮肤重复性好、标准化程度高。通过本发明制备的器官型全层皮肤在解剖和组织结构上更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合皮肤毒性作用的实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品、农药等健康相关产品的皮肤毒性试验。

主权项

1、一种采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法，依次包括以下几个步骤：(1)制作由胶原与细胞外基质混合物组成的复合胶原真皮支架：1)将壳聚糖与透明质酸、6-硫酸软骨素两者之一或全部混合制备成细胞外基质混合物；采用壳聚糖与透明质酸混合时质量比例为6.5-7.5∶2.5-3.5；采用壳聚糖与6-硫酸软骨素时质量比例为7.0-7.5∶2.5-3.0；采用壳聚糖、透明质酸、6-硫酸软骨素全部混合时质量比例为4.5-5.5∶2.5-3.5∶1.5-2.5；2)在无菌条件下将胶原浸泡于冰冷-4℃、0.1％的醋酸溶液中，胶原浓度为8-10mg/ml范围，调节PH值到7.2-7.3制备胶原溶液，操作应在4℃进行；3)在胶原溶液中加入1)步骤所得的细胞外基质混合物，得到复合胶原溶液，复合胶原溶液中细胞外基质混合物与胶原的质量比例为2-2.5∶7.5-8；4)取1ml制备好的复合胶原溶液置于孔径为3.5cm的圆形模具中或6孔细胞培养板中，用0.1ml的1％-1.5％的戊二醛溶液4℃共价交联24±0.5小时，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2-3次，制成海绵状复合胶原基质；5)将复合胶原基质用波长254nm、36W的紫外线照射除菌后放置在-25℃--30℃低温冰箱冷冻过夜12-18小时，然后再在-50℃--55℃、1Pa条件下，冻干机真空冷冻干燥24±1小时，制备复合胶原真皮支架；(2)原代培养人皮肤成纤维细胞和角质细胞的制备：1)将手术环切下的新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0.1mol/LPBS缓冲液彻底清洗，无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1.0mm×1.5mm的皮片，用质量浓度0.25％裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12-18小时，生理盐水或D-Hanks液清洗；2)表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.01％EDTA消化成单细胞悬液，用角质细胞无血清培养基重悬细胞，接种于IV型胶原包被的培养皿中，置5％CO2 37℃培养箱内孵育10-15min，吸出培养液及未贴壁细胞，用角质细胞无血清培养基继续培养人角质细胞；3)真皮部分以0.125％胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，放入含10％新生牛血清DMEM培养基培养；(3)人工真皮替代物制备：将第1步所得之复合胶原真皮支架置于12孔嵌入式培养皿上，加入含有10％新生牛血清的DMEM培养基湿润，以最小容量100-200μl接种第2步3)培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，培养7-10天，完成人工真皮替代物构建；(4)人工皮肤专用培养基制备：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，转移到DMEM液中；在无菌环境下，按培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，使羊膜上皮面向上全铺或半铺布于6孔板的孔底，然后加入角质细胞无血清培养基，收集羊膜分泌液；取角质细胞无血清培养基与人羊膜分泌液按体积比8-8.5∶1.5-2混合，再添加5×10-10M霍乱毒素，2.5μg/ml氢化可的松、25μg/ml胰岛素、25μg/ml转铁蛋白和1×10-10M甲状腺素T3、0.001ng/mL人重组EGF、24.3ug/mL腺嘌呤活性成分，配制成人工皮肤专用培养基；(5)器官型全层人工皮肤制备：在第3步所述人工真皮替代物上接种第2步2)原代培养的人角质细胞，接种细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制备的人工皮肤专用培养基代替角质细胞无血清培养基和含10％新生牛血清的DMEM培养基，采用气-液界面培养，8-10天后完成人工皮肤初级产品制备；(6)检测：同一批以12孔培养板制备的人工皮肤中，取其中一块人工皮肤从嵌入式培养皿取下，固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm-6μm，苏木素-伊红(H.E)染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构：去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层和角化层三层结构；真皮层含大量成纤维细胞，胶原纤维有序列排列，表皮真皮分界明显的人工皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。