一种高通量定向T载体克隆方法

摘要

本发明提出了一种高通量定向T载体克隆方法，它是选定合适的IIS型限制性内切酶位点和乳糖操纵基因序列(LacO)，通过载体诱变酶切连接转化和克隆片段间重构完整的乳糖操纵基因序列(LacO)，实现定向克隆和无鉴定克隆的；实现融合和非融合T载体的构建。本发明引物设计简单、克隆的效率高、耗用时间短、成本非常低、获得的重组子无需后续鉴定并兼容传统的克隆方法。

主权项

1、一种高通量定向T载体克隆方法，其特征在于具体步骤如下：A、选定合适的IIS型限制性内切酶位点和乳糖操纵基因序列(LacO)，首先选择IIS型限制性内切酶，IIS型限制性内切酶在目的识别位点之外切开DNA，本发明所用IIS型限制性内切酶的识别和切割位点如下所示：其中识别位点为方框中的a个特定碱基X，切割位点在n个任意碱基N之后，并突出3′端任意碱基N；再选择特定的乳糖操纵基因序列(LacO)，LacO序列有下列五种：方框中为乳糖操纵基因序列(LacO)的保守碱基；B.诱变目标载体，选定任意目标载体，对目标载体进行定点诱变，消除目标载体上在步骤1中选定的IIS型限制性内切酶位点和潜在的LacO序列；C.引入酶切位点和填充片段，诱变完成后，利用酶切连接或者PCR在紧邻着目标载体所需要的融合区域后引入两个相同的限制性酶切位点Bfu I和任意填充片段，以及13bp的部分LacO序列，即在目的融合区域后插入如下片段：Bfu I酶切位点——填充片段——Bfu I酶切位点——13bp的部分LacO序列，获得含有任意填充片段的载体；D.制备T载体，获得步骤3中的含有填充片段的载体后，用Bfu I酶切载体回收不含有填充片段的载体，即制备得到需要的T载体，其3′端均各突出一个“T”；E.扩增目的片段，针对特定的目的片段设计一对PCR引物F1、R1进行PCR或者RT-PCR扩增反应，PCR上游引物F1无特殊要求，PCR下游引物R1需要在5′端加上7个碱基的部分LacO序列5′CACAATT3′，PCR反应使用3′末端转移酶活性的Taq酶进行扩增；或者利用3′-5′proof-reading活性DNA聚合酶扩增，然后产物通过rTaq和dATP或者T4DNA聚合酶和dATP处理补加“A”；F.连接和转化。步骤5中片段无需回收，和步骤4中制备的T载体连接即可快转lac+的菌株感受态细胞或者含有lac+单元的菌株感受态细胞(如DH10β)，将转化菌液涂布LB平板，平板含有对应抗生素和15～30μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，37℃左右，避光培养；G.挑取目的转化子，培养9-16小时，挑取步骤6中平板上蓝色转化子，抽提质粒。