一种猪粪样总DNA的提取方法

摘要

本发明涉及微生物学和分子生物学技术领域，是一种猪粪样总DNA的提取方法，本发明主要包括粪便样品的预处理、样品总DNA提取。以采集新鲜粪便样品或冻存的粪便样品为材料，先用PBS缓冲液、多聚甲醛溶液、无水乙醇等进行粪便样品的预处理，获得粪样菌悬液；再以CTAB溶液、β－巯基乙醇等共同裂解细胞释放DNA。本发明具有操作简单、快捷、高效、重复性好以及经济等特点，所提DNA浓度、纯度及得率高，无需纯化就能直接用于PCR扩增等后续分子生物学实验研究。

主权项

1.一种猪粪样总DNA的提取方法，其方法特征在于按如下步骤操作：(1)取适量经过预处理的粪便样品菌悬液于1.5或2ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清；(2)加入0.8～1.5ml经60～70℃预热的裂解液及适量浓度的β-巯基乙醇溶液，混匀后60～70℃水浴0.5～1h，每隔几分钟取出摇匀一次；(3)12,000rpm离心5min，离心后，移出上清于另一无菌1.5或2ml离心管中，弃沉淀；(4)向上清中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，10,000rpm离心10min，取上清至另一无菌1.5或2ml离心管中；(5)加入等体积的氯仿，混匀后于10,000rpm离心10min，再取上清；(6)向上清中加入0.1倍体积的3M NaAC，混匀后再加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置30min以上；(7)12,000rpm离心5min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；(8)用75％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于100μl TE中，加RNaseA至终浓度为20μg/ml，37℃消化30min，之后于-20℃保存，备用；(9)以步骤(8)所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物P0：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，和1492r：5’-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3’扩增出粪便16S rDNA特异性条带并进行电泳检测。