利用牛体细胞核移植克隆胚胎的方法

摘要

本发明属于哺乳动物繁殖技术领域，具体涉及一种利用牛体细胞获得克隆胚胎的方法。公开了一种简单高效生产牛克隆胚胎的方法。根据猪体细胞膜在注入卵胞质内会在30min后自动溶解消失的研究成果，在牛中提出采用不破膜的全细胞为供体进行全细胞胞质内直接注射构建牛克隆胚胎；从而简化了体细胞核移植的操作流程。发明特征是：(1)牛卵丘－卵母细胞复合体的采集与培养；(2)卵母细胞的去核；(3)供体细胞的制备；(4)共培养细胞单层的制备；(5)重构胚的构建；(6)重构胚的激活；(7)重构胚的培养等。本发明最大的特点是易于操作、步骤简单、结果稳定，为牛体细胞核移植技术的推广以及进一步研究提供了一种新的思路和方法。

主权项

1、一种获得牛克隆胚胎的方法，其步骤包括：1)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养；2)将牛供体细胞注入受体卵母细胞中，获得重构卵母细胞；3)将步骤2)的重构卵母细胞激活，获得重构胚，其特征在于，将取出的牛卵母细胞在改良的成熟培养液中培养22h，培养温度39℃，使所述的牛卵母细胞处于第二次减数分裂中期，去除成熟卵母细胞的细胞核，获得牛受体细胞，采用全细胞直接注射法将牛供体细胞注入所述的牛受体细胞中，获得牛重构胚，将所述牛重构胚置于改良的成熟培养液的微滴中培养3-4h，然后将所述的牛胚胎暴露于激活培养基-1中激活5min，然后转移到激活培养基-2中激活3-4h，将激活的牛重构胚在胚胎培养液中培养7天，其中：改良的成熟培养液配比如下：以TCM-199商品液体培养基为基本培养基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mM，丙酮酸钠0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黄体素0.1IU/mL、雌激素1ug/mL、表皮生长因子100ng/mL，pH 7.0-7.2；激活培养基-1配比如下：基础液为改良的成熟培养液+离子霉素5μmol/L，pH 7.0-7.2；激活培养基-2配比如下：基础液为改良的成熟培养液+二甲基氨基嘌呤2mmol/L，pH 7.0-7.2；胚胎培养液配比如下：氯化钠107.63mmol/L+氯化钾7.16mmol/L+磷酸二氢钾1.19mmol/L+硫酸镁1.51mmol/L+青霉素钠0.012g/L+硫酸链霉素50μg/L+乳酸钠5.35mmol/L+碳酸氢钠25.00mmol/L+丙酮酸钠7.27mmol/L+氯化钙1.78mmol/L+肌醇2.77mmol/L+酚红10.0μg/mL+枸杞酸钠0.34mmol/L+必需氨基酸30.0μl/ml+非必需氨基酸10μl/mL+L-谷氨酰胺0.20mmol/L+BSA 3mg/mL，pH 7.0-7.2。