一种重组人尿激酶原的纯化方法

摘要

本发明涉及一种重组人尿激酶原的纯化方法，更具体地说是用色谱技术纯化制备重组人尿激酶原的方法。为了解决动物细胞表达的尿激酶原的大规模纯化问题，本发明公开了一种用Streamline-SP扩张床色谱、Sephacryl S-200凝胶色谱、对氨基苯甲脒Sepharose FastFlow亲和色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱法，从哺乳动物工程细胞培养液回收基因工程产品的方法。还可以在步骤C和D之间包括步骤E：用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱柱浓缩尿激酶原。采用上述方法得到符合SFDA要求的重组人尿激酶原，总回收率在70％以上，纯度达到99％以上。

主权项

1、一种重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于该方法包括如下步骤：A.用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗产品；C.用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D.用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA，其特征在于：所述步骤A是指将收集的细胞培养上清，调pH至5.5～6.8；色谱柱先用0.005～0.015mol/L pH 5.5～6.8磷酸盐缓冲液冲洗并平衡3～5个柱体积，然后加细胞培养上清，流速30～60ml/分钟，直至上清液全部通过色谱柱，再用同种缓冲液冲洗色谱柱，并用检测器监测色谱柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005～0.015mol/L pH 5.5～6.8磷酸盐缓冲液和0.005～0.015mol/L含0.8～1.2mol/L氯化钠，pH 6.8～7.8磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱吸附在色谱柱上的尿激酶原，收集洗脱蛋白吸收峰组分；所述步骤B是指将Sephacryl S-200凝胶色谱柱置于4℃并与一台制备型高效液相色谱仪相连，用0.005～0.015mol/L含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH 6.8～7.8磷酸盐缓冲液平衡1～2个柱体积；A收集的尿激酶原通过进样管上样，流速10～40ml/分钟，紫外检测波长280nm，收集蛋白吸收主峰流出液；所述步骤C是指将对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱柱进液管与蠕动泵相连，置于4℃，用0.005～0.015mol/L含0.2～0.6mol/L氯化钠，pH 6.8～7.8磷酸盐缓冲液平衡3～5个柱体积，将色谱柱出口与紫外检测器连接，将蠕动泵进液管插入B收集液中，用紫外检测器监测流出液，收集穿过蛋白吸收峰流出液；所述步骤D是指将DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱置于4℃，进液管与蠕动泵相连，出口端与紫外检测器相连，用0.005～0.010mol/L Tris-HCl缓冲液平衡3～5个柱体积，用Tris溶液调步骤C收集的穿过液pH至7.5～8.5后上柱，用紫外检测器在280nm波长下监测蛋白吸收值，收集蛋白质吸收穿过液，得到纯的重组人尿激酶原。