亚麻白粉病抗病基因分子标记

摘要

本发明属于亚麻白粉病抗病基因分子标记，亚麻白粉病抗病基因分子标记属于农业生物技术工程，特别涉及与亚麻白粉病抗性基因相连锁的分子标记及获得方法。本发明克服常规标记方法工作量大、易受环境影响、育种周期长等缺点。利用RAPD标记技术对亚麻抗白粉病材料(9801－1)、感病材料进行抗性筛选，研究亚麻白粉病抗性的遗传规律，筛选后得到与亚麻抗白粉病基因相连锁的分子标记。0PP02₇₉₂。标记用于抗白粉病亚麻的辅助选择育种，同时为克隆新的抗白粉病基因奠定了基础，为克隆亚麻抗白粉病基因、基因序列分析以及转抗白粉病基因亚麻研究奠定了良好基础。

主权项

1.一种亚麻白粉病抗病基因分子标记，其特征在于：与亚麻抗白粉病基因相连锁的分子标记，RAPD分子标记是用下述方法得到的：(1)抗病基因供体亲本来自于黑龙江省农业科学院经济作物所抗白粉病材料9801-1，其与感病品种ILONA、VENUS、DIANE进行正反交得到的F1和F2代群体，亚麻杂交后代白粉病抗性鉴定在田间进行，在温室内亚麻苗上繁殖白粉病病原菌，在亚麻快速生长期将病苗移到田间鉴定行间，使其分生孢子自然接种到鉴定植株上，待充分发病时观察叶片的发病情况，调查级别分为高抗、抗、中抗、感、高感五级，调查F2代群体抗感分离比，研究亚麻白粉病抗病基因遗传规律，(2)以SDS方法提取亚麻亲本及自交后代幼苗DNA：取叶片0.3g，放入1.5mL离心管中，于液氮中研磨成粉末状并加入750μL·65℃预热的SDS提取缓冲液，于65℃水浴中保温20-30分钟，取出离心管，加入5mol/L醋酸钾250μL，冰浴20-30分钟，而后在4℃下12000rpm离心15分钟，取上清液到另一1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇24∶1，在4℃下10000rpm离心10分钟，取上清液到另一1.5mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，于-20℃下放置30分钟，使DNA以沉淀析出，挑出DNA沉淀转移至1.5mL离心管中，用70％乙醇洗涤数次，用无水乙醇脱水，加入适量灭菌的超纯水，37℃溶解，0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，(3)采用RAPD分子标记方法，进行与亚麻白粉病抗性基因相关的分子标记的筛选：反应体系为：PCR扩增的反应体积为25μL，组成包括：3.5U TaqDNA聚合酶、10×buffer 2.5μL、1mM Mg2+、250μM dNTPs、0.4μM randomprimer、100ng模板DNA，PCR反应程序，94℃预变性5min，94℃变性40s、37℃复性60s、72℃延伸90s，共40个循环，最后72℃延伸10min，电泳检测，按1∶6-6×1oading buffer，PCR产物，比例把上样液与PCR产物混合后点样，在1.3％琼脂糖凝胶加溴化乙锭0.5μg/mL上电泳，电泳电压为3-4伏/厘米，保持10℃恒温，以DL2000marker作为分子量时照，配制胶的缓冲液为1×TAE，电泳缓冲液为0.5×TAE，(4)经RAPD分子标记0PP02792的连锁性鉴定，发现RAPD标记与抗白粉病基因共分离，分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用与前面同样的反应体系、引物及程序进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用Mapmaker3.0软件对分离群体单株的抗病性和分子标记的分离数据进行连锁分析，计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。