人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法

摘要

本发明公开了一种人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法，真核宿主为毕赤酵母X－33，主要包括以下步骤：(1)克隆人IL－7基因；(2)构建真核表达载体；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中；(4)酵母宿主中表达rIL－7蛋白。本发明改变传统的用原核宿主大肠杆菌表达IL－7，探索出用真核宿主毕赤酵母来表达IL－7的方法，既保证了IL－7生物学活性，又获得大量稳定的蛋白。

主权项

1、人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法，其特征在于：真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤：(1)克隆人IL-7基因：以人骨髓基质细胞提取总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增出总cDNA，再以该cDNA为模板，用IL-7特异引物扩增出完整rhIL-7基因片段，所用IL-7特异引物中引入Xho I酶切位点和在末端XbaI酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhIL-7/pMD20-T，经过测序确认为正确表达序列；(2)构建真核表达载体：将表达载体pPICZαB和质粒rhIL-7/pMD20-T经过XhoI和XbaI双酶后纯化回收，并用T4DNA连接酶于15-17℃连接15-17小时，得重组载体pPICZαB-IL7；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαB-IL7用SacI单酶切线性化后，用氯化锂转化方法转化入毕赤酵母X-33宿主菌株中；经过抗性筛选得到阳性克隆；(4)酵母宿主中表达rIL-7蛋白：挑取含有阳性克隆的毕赤酵母X-33宿主菌株，用BMGY培养基培养至光密度值＞2.0，离心收集细胞沉淀，用1L BMMY培养基重悬细胞并加入0.5％甲醇诱导，温度在26-28℃继续培养4天，每24小时补充甲醇使其中浓度保持0.5％，大量发酵表达IL-7蛋白，表达出的蛋白分泌在培养基中。