发明名称 |
烟草丛顶病毒检测方法 |
摘要 |
本发明提供一种烟草丛顶病毒检测方法,属植物保护领域。根据烟草丛顶病毒核苷酸序列设计特异性引物TB2F/TB2R,提取总RNA后采用RT-PCR的方法,直接检测烟草丛顶病毒。本发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术以及总核酸提取法的缺点,方便、特异、灵敏的检测烟草丛顶病毒。 |
申请公布号 |
CN100430715C |
申请公布日期 |
2008.11.05 |
申请号 |
CN200510048724.4 |
申请日期 |
2005.12.22 |
申请人 |
云南农业大学 |
发明人 |
李凡;王钰丽;陈海如;孙健;蔡红;吴德喜;程建勇;杨根华;马琨玲;钱宁刚 |
分类号 |
G01N21/64(2006.01);G01N21/78(2006.01);B01D57/02(2006.01);C12Q1/00(2006.01) |
主分类号 |
G01N21/64(2006.01) |
代理机构 |
昆明正原专利代理有限责任公司 |
代理人 |
刘明哲 |
主权项 |
1、一种烟草丛顶病毒检测方法,它包括以下步骤:(1)引物设计设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F,扩增的目的核酸带大小为550bp,引物序列如下:TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′(2)总RNA提取:①称取烟草叶片50mg,放入研钵中,加入1mL Trizol试剂研磨;研磨液倒入1.5mL离心管中;②在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿,混匀后静置5min;③12,000rpm离心10min;④上清液移至一新1.5mL离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀后静置5min;⑤12,000rpm离心10min;⑥弃上清,沉淀用1mL 70%乙醇洗涤,干燥10min;⑦沉淀用40μL DEPC处理水悬浮,-20℃保存备用;(3)RT-PCR扩增①反转录合成cDNA:取提取的总RNA模板2μL,加入引物TB2R 1μL,9.5μL RNAase-free H<sub>2</sub>O,充分混匀后70℃温浴10min,迅速冰浴5min;加入以下试剂:<img file="C2005100487240002C1.GIF" wi="1343" he="508" />轻弹管壁混匀,稍离心后室温10min,42℃保温60min;②PCR扩增:在PCR管中加入以下试剂:<img file="C2005100487240003C1.GIF" wi="1630" he="890" />轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min,94℃变性1min、52-58℃退火1min、72℃延伸2min,共31-39次循环,最后72℃延伸10min;(4)电泳检测:取5μL PCR产物经0.8%-1.5%琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后,在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min,用紫外透射仪观察;在感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带。 |
地址 |
650201云南省昆明市北郊黑龙潭云南农业大学 |