主权项 |
1、一种云柚菇抗病毒蛋白的分离纯化方法,其特征在于包括以下步骤:(1)称取云柚菇子实体干品粉末15g,加入200mL的蒸馏水,4℃静置浸提8h-10h,4℃10,000r/min离心15min,收集上清液;将上清液用0%-40%的(NH4)2SO4沉淀,4℃静置4h-8h,4℃11,000r/min离心25min,弃沉淀,得上清A液;将A液再40%-60%的(NH4)2SO4 沉淀,4℃静置4h-8h,4℃11,000r/min离心25min,得上清B液;B液再60%-80%的(NH4)2SO4沉淀,静置4h-8h,4℃11,000r/min离心25min,得沉淀;将沉淀用蒸馏水悬浮,透析袋中对pH7.8,0.01mol/L PBS缓冲液透析24h,中间换液3-4次,得蛋白液,4℃10,000r/min离心10min,弃沉淀,得上清液C液;(2)离子交换层析:采用1.6cm×10cm柱子,DEAE-sepharoseFF装柱后,用pH7.8,0.01mol/L PBS缓冲液平衡柱子;将C液上样,结束后用pH7.8,0.01mol/L PBS缓冲液洗柱,然后用0mol/L-0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,流速1.5mL/min,分部收集流出液,将收集的各管在280nm下测紫外吸收值;选紫外吸收值最高的流出液作透析处理24h,换液3-4次,将透析液用聚乙二醇20,000浓缩并收集,检测抗TMV活性,得D液;(3)凝胶层析:用含0.15mol/L NaCl的pH7.8,0.01mol/L PBS缓冲液平衡Sephacryl S-200,D液上样1.5mL,流速0.15mL/min,分部收集流出液,将收集的各管在280nm测紫外吸收值;选紫外吸收值最高的流出液作透析处理,并进行抗TMV活性和纯度检测,得YY蛋白液,经冻干处理,得YY蛋白。 |