| 主权项 |
1、一种检测脱氧核糖核酸的单核苷酸多态性的方法，具有以下步骤：①确定要对某种生物的脱氧核糖核酸的某种基因进行检测，也就是确定待测DNA片段，而该待测DNA片段的一条单链上的一段核苷酸序列中的某一个特定核苷酸可能发生变异；这段包含可能发生变异的特定核苷酸的核苷酸序列可称为靶序列；而其中的可能发生变异的特定核苷酸所处的位置可称为变异位点；②制备一种由寡核苷酸和荧光基团组成的碱基淬灭探针；碱基淬灭探针的寡核苷酸互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的野生型基因的相应DNA片段的相应序列、或互补于与待测DNA片段的靶序列相对应的突变型基因的相应DNA片段的相应序列，碱基淬灭探针的寡核苷酸的一端仅一端结合有荧光基团，荧光基团可以标记在碱基淬灭探针的寡核苷酸的5’或3’端，当荧光标记在5’端时，探针的寡核苷酸的3’端必须采用磷酸基团进行封闭；③制备合适的两个寡核苷酸引物，该两个寡核苷酸引物中的一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的一条单链的一端的一段序列互补，该两个寡核苷酸引物中的另一个寡核苷酸引物与上述待测DNA片段的另一条单链的另一端的一段序列互补；④由过量的底物、DNA聚合酶、过量的寡核苷酸引物、以及含有待测DNA片段的脱氧核糖核酸组成反应体系，还加入碱基淬灭探针，在上述反应体系中进行聚合酶链式反应，而使上述待测DNA片段扩增；⑤对上述进行聚合酶链式反应后的体系加热，直至使扩增后的待测DNA片段变性而使其双链解开，然后降温而使碱基淬灭探针的寡核苷酸杂交于扩增后的待测DNA片段的单链的靶序列上，此时的碱基淬灭探针的寡核苷酸处于与靶序列互补的状态；若在碱基淬灭探针的寡核苷酸处于单链状态时对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用较弱，若在碱基淬灭探针的寡核苷酸与靶序列杂交生成双链后的互补状态下对碱基淬灭探针的荧光基团进行激发，则与荧光基团毗连的碱基对荧光基团所发荧光的淬灭作用加强；⑥在对探针的荧光基团进行激发的同时，加热杂交后的体系，结合于待测DNA片段的单链的靶序列上的碱基淬灭探针会脱落下来，碱基淬灭探针的脱落使其恢复到单链状态而对外显示出的荧光增强，随着温度的继续升高，碱基淬灭探针脱落增加，荧光强度也随着增强，将其中的荧光强度增量变化最大时的温度作为融解温度；若该融解温度值与同样条件下野生型基因的相应的DNA片段的相应的融解温度值之间有明显的差别，则说明所测脱氧核糖核酸具有单核苷酸多态性。 |
