多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法

摘要

本发明涉及一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法，是建立在特定探针设计、多元连接酶检测反应、多聚酶链式反应联用的基础上，对已知序列的单基因或多基因的任意突变位点同时进行基因精确分型的方法；本发明的有益效果是：能够对已知序列的单基因的任意位点进行精确基因分型；能够同时对已知序列的多个基因的任意位点进行精确基因分型；可以用于基因的高通量分型检测，或常规的低通量实验室操作。

主权项

1. 一种多元连接酶检测反应等位基因精确分型的方法，是通过以下步骤实现的：根据待测序列和位点突变情况，设计一组“多元核酸引物/探针”，每组至少包括：引物1：含该检测位点的配对碱基A，能与待测位点左端局部配对(退火)，并与该待测位点的野生型完全配对；引物2：含该检测位点的不配对碱基C，能够与待测位点左端局部配对或退火，并不与该待测位点的野生型配对；1条能够与待测位点右端局部配对或退火，并在5’末端带有磷酸基，同时在3’末端带有荧光标记的AMLR探针；上述一组“多元核酸引物/探针”与待测脱氧核糖核酸序列混合，进行变性和退火，在反应体系中就可能形成两种杂交分子：引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探针与其右端退火；用Taq脱氧核糖核酸连接酶进行连接反应，则对于上述2种杂交分子会产生不同的结果：由于引物1与待测目标脱氧核糖核酸分子左端和待测位点均能够完全退火，与右端退火的AMLR探针之间不会形成缺口，能够完成连接反应，形成连接产物；由于引物2与待测目标脱氧核糖核酸分子的待测位点不能够实现退火，与右端退火的AMLR探针之间会形成单碱基不配对区，不能够完成连接反应，无法形成连接产物；将反应体系进行热变性，只能得到引物1-AMLR探针的有效连接产物；对反应体系进行多聚酶链式反应，扩增引物1-AMLR探针的量即可供荧光检测或电泳检测。对于突变型待测样本得到与上述相反的结果，即：形成引物2-AMLR探针连接产物；对于一个待测位点只存在两种等位基因形式的群体样本，最都可能会有三种检测结果：即单一的长扩增片段、单一的短扩增片段、长短扩增片段；如果待测位点具有多个突变形式，则在设计上只需增加相应特定引物的种类，无须改变AMLR探针；如需要改变检测位点，则二者的设计都应作相应改变。