一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法

摘要

本发明涉及一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法，属于植物细胞工程领域。该方法通过确定试材、选取花蕾、花蕾预处理、制备液固两种培养基、两种培养基的灭菌与分装、花蕾消毒、无菌剥取花药、花药接种、花药培养、小孢子的自然游离和胚状体形成等步骤，获得了小孢子胚状体，且胚状体能正常生长，成苗率高。本发明从开始培养到获得胚状体一般需要8周时间。本发明若应用于育种实践，必将大大加快育种进程，显著地提高选择效果，节省大量人力、物力，是一项加速育种纯系选育的有效方法。

主权项

1. 一种辣椒小孢子诱导获得胚状体的培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)确定试材：选取杂交一代辣椒品种作为试验材料；(2)选取花蕾：在开花初期或盛期，通过醋酸洋红压片法镜检选取处于单核靠边期的花蕾，其外观形态特征表现为花冠与花萼等长或花冠稍长于花萼，定期摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；(3)花蕾预处理：合适的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理1～3天；(4)制备液体培养基和固体培养基：两种培养基所用的基本培养基均为Nitsch and Nitsch培养基，所用的碳源为麦芽糖，其浓度为2％～3％；固体培养基添加的凝固剂为琼脂，其浓度为0.6％～0.8％；固体培养基的组成成分为：在Nitsch and Nitsch培养基中，加入培养基重量的0.6％～0.8％琼脂，2％～3％的麦芽糖，0.5％～1.0％的活性炭，pH 6.0；液体培养基的组成成分为：在Nitsch and Nitsch培养基中，加入2％～3％的麦芽糖，0.4～0.8mg/L的玉米素ZT，0.5mg/L～1.0mg/L的吲哚乙酸IAA，pH 5.8；(5)培养基的灭菌与分装：固体培养基于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟，液体培养基用装有两层微孔滤膜的塑料滤器过滤灭菌，保证培养基的无菌状态；灭菌后每一培养皿先注入固体培养基6ml，等固体培养基凝固后，再加入液体培养基3ml，进行分装；(6)花蕾消毒：先用流水冲洗30分钟，再用体积分数70％的酒精表面消毒30秒钟，之后用体积分数5％的次氯酸钠消毒12～15分钟，然后用无菌水冲洗4次，每次5分钟；(7)无菌剥取花药：在无菌滤纸上用消过毒的镊子剥取花药，避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净；(8)花药接种：每一培养皿放入12枚花药，用石蜡膜封口；(9)花药培养：培养皿置于培养箱中，在9℃条件下暗培养一周，后转入白天25℃、夜间20℃的组织培养室，继续暗培养；(10)小孢子的自然游离胚状体形成：在液固双层培养系统下，花药漂浮在上层的液体培养基上，经过2～3周，花药正常裂开，把小孢子释放入培养基中；(11)胚状体的发育形成：培养4周后，肉眼可见球型胚和心型胚，培养7周后，可见鱼雷型胚和子叶型胚，培养10周后，子叶型胚非常明显，之后把子叶型胚转入胚萌发培养基上，形成完整植株。