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1、一种痰中增殖诱导配体mRNA定量测定方法，其特征是：包括下列步骤：(1)引物合成：依据Genebank收录人APRIL mRNA和β2微球蛋白mRNA，用Primer Premier 5.0软件设计引物，其中APRIL和β2M引物跨内含子，APRIL下游引物跨越327bp的第1个内含子，β2M上游引物跨越3811bp的第1个内含子；APRIL上游引物：5’-ACT CTC AGT TGCCCT CTG GTT G-3’(819nt～840nt)，APRIL下游引物：5’-GGA ACT CTGCTC CGG GAG ACT C-3’(984nt～1005nt)，扩增片段长度187bp；β2M上游引物：5’-CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3’(119nt～136nt)，β2M下游引物：5’-GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3’(342nt～360nt)，扩增片段长度242bp；(2)APRIL定量质粒标准品及β2M定量质粒标准品的构建：a)标本收集及预处理：收集对象晨起用清水漱口后，咳深部痰2～3口于无菌痰盒内，用力振荡，混匀。痰内加入适量0.1％二硫苏糖醇解粘，振荡液化10～20min至痰中无粘稠痰块呈均匀液相后，用70μm尼龙筛网过滤至10ml消毒玻璃管内，4℃1200rpm离心8min，弃上清，管底沉淀物用1×磷酸盐缓冲液(PBS液)洗2遍，再用1×PBS液重悬，制成细胞悬液，镜下计数细胞，调细胞悬液浓度至1×106/mL，-70℃冰冻保存，留作RNA提取用；b)总RNA提取和逆转录：取预处理后痰标本细胞悬液0.8mL加1mLTrizol提取总RNA，取总RNA 0.8μg，以特异性抓尾引物Oligo(DT)18 为引物逆转录为cDNA，分装后-20℃保存；c)APRIL定量质粒标准品的构建：取上述cDNA 2μl用APRIL上、下游引物于PTC-200PCR循环仪进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min，94℃30s、62℃40s、72℃30s，33个循环，72℃延伸5min。PCR产物用胶回收试剂盒回收，回收产物与pGEM-T easy载体4℃连接12～16h，将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于经2％X-gal和20％IPTG处理的含75μg/ml氨苄青霉素的LB平皿上，37℃倒置培养12～16h，经蓝白斑筛选，白色菌落经PCR初步鉴定后，阳性克隆进行测序分析，将筛选出的阳性菌株扩增，抽提质粒，用核酸蛋白分析仪准确定量，并进行10倍系列稀释作为标准品，分装后-20℃保存；d)β2M定量质粒标准品的构建：取上述cDNA 2μl，以β2M上、下游引物于PTC-200PCR循环仪扩增目的片段，其余步骤同APRIL定量质粒标准品的构建，得到10倍系列稀释β2M定量质粒标准品，分装后-20℃保存；(3)痰中APRIL mRNA含量测定：将待测痰液用与步骤(2)相同的标本收集及预处理、总RNA提取和逆转录方法合成cDNA；将其中2μlcDNA模板加入18μl PCR反应液，所述PCR反应液中含1×PCRbuffer，4.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，APRIL上、下游引物各0.15μmol/L，20×SYBR Green I 0.3μl，Taq DNA聚合酶1.5U；混匀后加入Roche专用毛细管中，并设立以水作模板的空白对照、以空载质粒作模板的阴性对照和相应的6个浓度分别为109、108、107、106、105、104copies/ml的质粒标准品，各反应管于Roche荧光定量检测仪进行APRIL PCR扩增，扩增参数为：94℃预变性3min；94℃5s，62℃35s，86℃1s读取荧光度值，40个循环，测出待测样本中APRIL准确含量；另将2μlcDNA模板加入18μl PCR反应液，所述PCR反应液中含1×PCRbuffer，4.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，β2M上、下游引物各0.15μmol/L，20×SYBR Green I 0.3μl，Taq DNA聚合酶1.5U；混匀后加入Roche专用毛细管中，并设立以水作模板的空白对照、以空载质粒作模板的阴性对照和相应的6个浓度分别为109、108、107、106、105、104copies/ml的质粒标准品，各反应管于Roche荧光定量检测仪进行β2M PCR扩增，扩增参数为：94℃预变性3min；94℃5s，60℃35s，81℃1s读取荧光度值，40个循环；测出待测样本中β2M准确含量。 |
