发明名称 |
猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用 |
摘要 |
本发明公开了一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用,其步骤是:克隆猪的NAGS基因,根据该基因序列设计并合成引物,将获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质粒pLM1-NAGS转化到大肠杆菌BL21中;培养转化重组质粒的BL21到OD值为0.4;在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0.2mM,诱导;将诱导后的菌体离心收集,用PBS重悬,加入溶菌酶裂解,再超声波破碎,把破碎后的菌液离心,收集上清;使用Hitrap chealtingHP镍亲和层析柱纯化蛋白;用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔,得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体,用不完全福氏佐剂加强;得到相应的抗血清。本发明能检测不同发育阶段NAGS在哺乳仔猪体内的分布和表达活性的变化。 |
申请公布号 |
CN101265475A |
申请公布日期 |
2008.09.17 |
申请号 |
CN200810031259.7 |
申请日期 |
2008.05.09 |
申请人 |
印遇龙 |
发明人 |
印遇龙;黄瑞林;储武英 |
分类号 |
C12N15/52(2006.01);C12N15/70(2006.01);C07K16/40(2006.01);G01N33/573(2006.01) |
主分类号 |
C12N15/52(2006.01) |
代理机构 |
长沙永星专利商标事务所 |
代理人 |
周咏;米中业 |
主权项 |
1、一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法,其特征是包括如下步骤:1)克隆猪的NAGS基因,根据该基因序列设计并合成引物:NAGSF:5′-CGCGCGAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCA CCATCACCATCACGACATGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3′;NAGSR:5′-CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3′,其中Sal1酶切位点5’G’TCGAC 3’,EcoR1酶切位点5’G’AATTC 3’,CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签,通过RT-PCR扩增猪NAGS基因的编码区序列,其全长为1107bp;2)将步骤1)获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质粒pLM1-NAGS转化到大肠杆菌BL21中;3)培养转化重组质粒的BL21到OD值为0.4;4)在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0.2mM,诱导;5)将诱导后的菌体离心收集,用PBS重悬,加入溶菌酶裂解,再超声波破碎,把破碎后的菌液离心,收集上清;6)使用Hitrap chealting HP镍亲和层析柱纯化蛋白;7)用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔,得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体,用不完全福氏佐剂加强;8)测抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效价,取血,得到相应的抗血清。 |
地址 |
410125湖南省长沙市芙蓉区马坡岭中国科学院亚热带农业生态研究所 |