无需克隆的线性表达载体构建方法

摘要

本发明涉及一种线性表达载体的构建方法，具体地，本发明提供了一种利用非对称性切割的限制性内切酶来构建线性表达载体的方法。该方法能大大降低线性表达载体的构建成本，使这种载体的构建方法能在科研和生产中得到广泛应用。

主权项

1.一种构建线性表达载体的方法，其步骤包括：(1)设计引物：a.在启动子和目的基因相邻的DNA片段连接处，设计由引物1和引物2构成的一对引物，引物1和引物2包含与待连接片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶识别的DNA序列，并且引物1和引物2中的酶识别序列是同一个内切酶识别的序列；在目的基因和终止子相邻的DNA片段连接处，设计由引物1’和引物2’构成的一对引物，引物1’和引物2’包含与待连接片段互补的DNA序列和一段非对称性切割的限制性内切酶识别的DNA序列，并且引物1’和引物2’中的酶识别序列是另一个内切酶识别的序列；b.启动子正向引物和终止子反向引物仅包含和扩增片段互补的DNA序列；(2)将上述各引物分别加入到相应的三个DNA片段模板中，并分别进行PCR扩增反应，得到扩增产物；(3)分别纯化步骤(2)得到的扩增产物，并分别用非对称性切割的限制性内切酶酶切片段中的酶识别序列；(4)将酶切后的待连接片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应，得到含目的基因的线性表达载体。