一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法

摘要

本发明公开了一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，该方法以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为原始材料，对外植体进行愈伤组织诱导、继代培养，建立悬浮细胞系，通过悬浮细胞系诱导不定根，通过不定根的稳定性培养、继代保存、培养条件优化，即可用于扩大培养生产雷公藤甲素和生物碱。该方法得到的不定根中雷公藤甲素和总生物碱的含量分别为根皮粉的13倍和1.8倍，培养液中雷公藤甲素产量占55～60％，总生物碱产量占60～65％。利用该方法生产雷公藤甲素和总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

主权项

1.一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体，用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl2消毒4min，无菌水冲洗4次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25±1℃，保持每天12小时的光照，光照强度为1000～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6，7-V+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT；步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为5％～10％(w/v)，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25+1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养3次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系；步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在1mm以下、分散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在NT培养基上进行不定根的诱导，接种量为鲜重5g/L～10g/L，NT培养基的组成为：NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(2～6)mg/L NAA+(0.1～0.5)mg/L KT，培养30天可产生不定根，继续培养至45天，有85％的细胞团产生长度为0.5cm～3cm的不定根；步骤六，不定根的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱导的不定根中，根长度为1cm～2cm、细胞团直径在2mm以下、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在步骤五相同培养基上连续培养5代以上，即可形成稳定的不定根培养体系；同时将筛选的生长旺盛、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，继代保存在MS培养基中，35天继代一次，MS培养基组成为0.5～1.0mg/L 2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖30～40g/L，pH值为5.8；步骤七，对不定根进行生产培养时，在NT培养基中加入0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值为6.4，培养至第35天时加入经过滤灭菌的AgNO3(5～10)mg/L，培养至第50天收获。