一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法

摘要

一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法，属于生物医药技术领域。本发明根据GenBank中鼠IL－15Rα的cDNA序列，设计针对sIL－15Rα编码序列的引物对；Trizol法提取小鼠脾脏细胞总RNA，以Oligo T为引物合成cDNA第一链，并以此为模板进行PCR扩增；PCR产物与pMD18－Tsimple载体连接，得pMD18－T/sIL－15Rα重组质粒，经双酶切后再与表达载体pQE－30连接，获pQE－30/sIL－15Rα重组表达质粒，并转化至M15感受态细菌；通过降低诱导温度和异丙基－β－D－硫代半乳糖浓度的方式实现了重组蛋白的可溶性表达，进而通过与Ni－NTA金属螯合柱选择性结合实现了重组蛋白的一步纯化。每升菌中可纯化得到约7mg重组蛋白，纯度大于95％。

主权项

1、一种可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达及纯化方法，其特征是(1)引物设计：根据已知的GenBank中鼠IL-15Rα的cDNA序列，设计可溶性IL-15Rα，即sIL-15Rα，编码序列的引物对，在上游引物P1的5′端引入BamH I酶切位点，在下游引物P2的5′端引入Sal I酶切位点，酶切位点用下划线标示，引物序列如下：P1，5′-GTAGGATCCGTCACCACGTGACCACCTC-3′；P2，5′-GATGTCGACTATCGTCATTCTCGAACTG-3′；(2)sIL-15Rα基因克隆及重组表达质粒pQE-30/sIL-15Rα的构建：将体外培养的小鼠脾脏细胞用100U/mL干扰素-γ刺激24h，Trizol法提取细胞总RNA，以Oligo T为引物合成cDNA第一链，并以此为模板，用P1和P2进行PCR扩增；PCR条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环；72℃5分钟；PCR产物经电泳分离、割胶回收后，与pMD18-T simple载体连接，得pMD18-T/sIL-15Rα重组质粒，并转化至TG1感受态细菌，经测序确证的重组质粒pMD18-T/sIL-15Rα经BamH I和Sal I双酶切，所释放的sIL-15Rα基因片段与经同样双酶切的表达载体pQE-30连接，获pQE-30/sIL-15Rα重组表达质粒，并转化至M15感受态细菌，命名为pQE-30/sIL-15Rα/M15；于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的固体LB培养基上挑取单个菌落，用PCR和酶切鉴定；(3)sIL-15Rα的诱导表达：挑取经鉴定确证的单菌落，接种于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日，按1∶100比例接种于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养至A600值达0.5～0.8，加异丙基-β-D-硫代半乳糖至终浓度为1.0mmol/L，继续振荡培养，于诱导1h、3h及5h后分别收集菌液，加等体积SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取10μL进行SDS-PAGE和Western blot分析，以转空载体pQE-30的M15菌作为对照；(4)sIL-15Rα的可溶性诱导表达及纯化：将pQE-30/sIL-15Rα/M15菌于37℃振荡培养至A600值达0.5～0.8，在28℃、0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖条件下诱导培养4h，诱导培养物再经4℃、10000g离心30min，收获pQE-30/sIL-15Rα/15菌体沉淀；用含50mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、1.0g/L溶菌酶、1mmol/L PMSF，pH8.0的裂解缓冲液100mL重悬菌体，冰上放置30min，超声裂解后，4℃、10000g离心30min，收集上清并用0.45μm孔径滤膜过滤，于上清中加咪唑至终浓度为20mmol/L后，过Ni-NTA亲和层析柱，用含有40mmol/L、60mmoI/L、100mmol/L咪唑的20mmol/L NaH2PO4、500mmol/LNaCI，pH7.4的洗脱缓冲液，依次洗柱除杂，最后用含500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE鉴定洗脱目的蛋白的纯度。