基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法

摘要

本发明公开了一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法。该方法首先选择合适的两种限制性内切酶作用于样品基因组DNA，得到包含转基因特征序列的目的DNA片段；然后将其与生物素标记探针杂交，以起到筛选目的DNA片段的作用；与高效电化学发光探针杂交，实现高灵敏度电化学发光检测；最后，根据标准曲线，对样品中的转基因成分进行定量分析。本发明方法通过引入基于纳米/微米粒子放大信号原理制备的高效电化学发光探针来实现对原始样品的直接检测，该法具有灵敏、快速、简便、安全、结果准确等优点，更适合在实际检测中推广应用。

主权项

1、一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于包括如下步骤：一)提取待测样品的基因组DNA；二)用基因分析软件对转基因样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，酶切产物中含有包含转基因特征序列的目的DNA片段；三)将步骤二)中得到的酶切产物与DNA Markers同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收该长度的DNA片段；四)用基因分析软件根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列，所述特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组中其它任何序列互补：其中，一段为生物素标记探针序列，制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列，其一端修饰上与纳米/微米粒子连接的活性基团，制备成高效电化学发光探针；五)将步骤四)制备的生物素标记探针和高效电化学发光探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度90～95℃、2～10分钟，然后降温至45～70℃、20～120分钟；得到杂交产物；六)将步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在pH 7～8的PBS缓冲液或pH 7～8的TE缓冲液中进行孵育连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中；七)向检测样品池中加入含有能够与三联吡啶钌即TBR产生电化学发光反应的物质的电化学发光分析液，给定电压1～1.5V，TBR与该物质发生电化学发光反应，产生光信号；检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值，判断待测样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。