利用硫代寡核苷酸探针的DNA测序方法

摘要

利用硫代寡核苷酸探针的DNA测序方法进一步降低DNA的测序成本，提高每一个序列的测序长度，并缩短每个碱基的阅读时间。通过一种含硫代核苷的测序引物，采用杂交－酶连接－酶切割的高通量测序技术，为DNA序列分析提供一种新方法，建立快速、准确、和低成本的高通量DNA序列测定技术。本发明的最大优点是实现了DNA序列测定的标记杂交序列的简易合成以及方便将标记物切除，由于杂交的高通量引物是通过非常成熟的固相DNA方法合成并纯化得到，因此该方法没有错误延伸的累积效应，能够维持DNA模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠。

主权项

1.一种利用硫代寡核苷酸探针的DNA测序方法，其特征在于测序步骤为：A.硫代寡核苷酸探针的构建：硫代寡核苷酸探针序列的5’-3’端依次为锚定区、识别区和剪切区，锚定区含有n个核苷酸或碱基类似物，其中0＜n≤10；识别区含有m个核苷酸或碱基类似物，其中0＜m≤10，并且识别区3’端第一个核苷酸或碱基类似物与5’方向邻接着的核苷酸或碱基类似物之间为硫代修饰的磷酸键；剪切区含有k个核苷酸或碱基类似物，其中0＜k≤10；剪切区序列上设有与识别区对应的标记物；B.测序循环：a).利用测序定位引物与待测单链DNA模板进行杂交，清洗去除多余的测序定位引物；b).将硫代寡核苷酸探针与步骤a所得待测单链DNA模板进行杂交，在连接酶的作用下，与待测单链DNA模板完全匹配的硫代寡核苷酸探针和紧邻着测序定位引物完成连接反应，然后清除未连接以及游离的硫代寡核苷酸探针；c).读取标记物的信号种类和强度，确定此次与识别区互补的待测单链DNA模板的信息；d).利用受阻于硫代修饰磷酸键的外切酶去除步骤c所得测序定位引物相连的硫代寡核苷酸探针上的剪切区；e).重复上述步骤b-d 2～10次，完成该轮测序。f).对步骤e所得产物进行变性，得到初始的待测单链DNA模板，用3’端比上一轮少一个核苷酸的测序定位引物重复a-e步骤；g).重复f步骤n-1次。