测定糜蛋白酶或胰蛋白酶或弹性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法

摘要

本发明公开了一种测定糜蛋白酶或胰蛋白酶或弹性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法，本发明以酪蛋白为底物，分别加入各酶催化，用三氯乙酸终止酶催化反应并与剩余底物相互作用形成缔合微粒使得共振散射强度急剧加强，据此建立了一个测定糜蛋白酶或胰蛋白酶或弹性蛋白酶或胃蛋白酶活力的方法，酶活力浓度——共振散射校正值曲线算出。本发明的优点在于：与现有的方法相比，本方法将酶催化反应与共振散射光谱结合起来，分析灵敏度高，选择性好，检测限低，操作简便，并且所用试剂无毒安全。

主权项

1.测定糜蛋白酶或胰蛋白酶或弹性蛋白酶或胃蛋白酶活力的催化共振散射光谱法，其特征是：检测方法包括如下步骤：(1)制备已知酶活力单位的各酶的测试体系：①具塞刻度试管中，依次加入0.09～0.10mg/mL酪蛋白置于50℃水浴锅中预热10min，取出加入适量上述各蛋白酶，用对应的缓冲液(其中胰蛋白酶或糜蛋白酶或弹性蛋白酶分别用pH 8.0、7.5、8.0的0.2mol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，胃蛋白酶用0.1mol/L pH 1.65甘氨酸-NaCl-HCl缓冲液)稀释至一定体积，摇匀并立即开始计时放回水浴锅中反应，其中糜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶温育60～65min，弹性蛋白酶温育30～35min；②反应时间到后，取出依次加入0.5～0.6mol/LTCA，用二次蒸馏水定容至5.0mL，摇匀，放置10～30min；③用荧光分光光度计同步扫描激发和发射波长(λem-λex＝0nm)得到体系的RSS光谱，在360nm或400nm或420nm或470nm或520nm处测定体系的散射光强度I；(2)用步骤一的方法制备上述各酶的试剂空白体系，并测定各酶的试剂空白IO；(3)计算各酶的ΔI＝I-IO；(4)以加入的酶的浓度c为横坐标，ΔI为纵坐标，绘制各酶工作曲线；(5)用步骤一的方法制备检测体系，其中加入的是未知浓度的待测样品，测定各样品的ΔI；(6)根据工作曲线，即可求得某检测样品中待测酶在一定线性范围内的浓度。