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1.一种分析浮游生物群落DNA多态性的方法，其步骤是：A、样品采集：用有机玻璃采水器分别采集等体积的表、底层水混合，水样混匀后用GF/C滤膜过滤0.2-0.5L水样；B、浮游生物群落DNA提取：将过滤后的GF/C滤膜在无菌的条件下剪碎，并浸没于装有3mL裂解缓冲液的离心管中，裂解缓冲液成分为0.5％SDS，10mM Tris-Cl，100mM EDTA及0.1mg/mL蛋白酶K；55℃水浴裂解10h，10000r/min离心5min后将上清转入一新的离心管，再次离心取上清经等体积的酚→酚∶氯仿(1∶1)→氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇于-20℃沉淀3h，13000r/min离心10min后去上清并用70％的乙醇清洗3次，每次清洗完于13000r/min离心10min、弃上清，干燥后加入20-50μL TE溶解，DNA存于-20℃备用；C、随机扩增多态性DNA分析：首先对PCR反应体系中的DNA、Mg2+、dNTP、Taq酶及引物浓度和循环参数进行优化，其次是从2-5组随机引物筛选出扩增结果稳定、谱带清晰、多态性好的7-10条随机引物对浮游生物群落DNA进行PCR扩增；在25μL体系中包含50-100ng DNA，1×Buffer，2mM Mg2+，80μM dNTP，0.8μM 10个碱基长度的随机引物，1.5U Taq酶，混匀后离心将反应液集中于管底进行以下扩增：94℃预变性5min，后接45个循环，最后于72℃延伸5min，反应终止于4℃，PCR产物用1.4％-2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分离、UVP成像分析系统拍照；D、浮游生物群落核糖体RNA基因的PCR扩增及变性梯度凝胶电泳分析：分别采用针对16S rDNA的引物和18S rDNA的引物对浮游生物群落DNA进行PCR扩增，50μL体系中含有40-100ng DNA，1×PCRBuffer，2mM Mg2+，80μMdNTP，3.0U Taq酶，正、反向引物各0.3μM，反应物混匀后离心将反应液集中于管底进行如下扩增：94℃变性5min后进行递减PCR，每个循环94℃变性30s，低温退火30s，72℃延伸60s，最后于72℃延伸10min，反应终止于4℃，通过1.4％-2.0％琼脂糖凝胶电泳确认目的片段并确定后续变性梯度凝胶电泳的上样量，等量的PCR产物用9％的丙稀酰胺通过INGENYphorU-2系统进行变性梯度凝胶电泳，变性剂梯度范围为40％-60％，60℃恒定温度以50-60mA的恒定电流电泳12-16h，经1×SYBR Gold染色后用UVP成像分析系统拍照；扩增16S rDNA的引物：正向引物P1：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物P2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；扩增18S rDNA的引物：正向引物P3：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；反向引物P4：5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’；E、利用Quantity One软件对图谱进行定性、定量分析：RAPD/DGGE指纹图谱通过凝胶专业分析软件Quantity One进行定性和定量分析，进而对不同时空样品浮游生物群落DNA多态性进行对比分析，获得不同环境条件浮游生物群落DNA指纹结构的相似性矩阵。 |
