肿瘤血管导向肽与人干扰素α－2b的融合蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白的制备方法。本发明选用从噬菌体展示文库中筛选出的能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的CD13结合的含13个氨基酸的环肽NGR，利用基因工程方法将其融合在IFNα-2b的羧基末端，制备的肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与IFNα-2b的融合蛋白，能在肿瘤新生血管处富集，从而提高干扰素α-2b的治疗特异性，减少全身用量，降低毒副反应，提高量效比。

主权项

1.一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b融合蛋白的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：1)编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与IFNα-2b融合蛋白基因的克隆：选择人白细胞cDNA文库，首先设计一对引物将5’端和3’端的酶切位点分别突变为NdeI和BamHI；引物P1：5’-CGC ATA TGT GTG ATC TGC CTC AAA CC-3’；引物P2：5’-CGG GAT CCT TCC TTA CTT CTTAAA CTT TCT TGC AAGTTT GTT GAC AAA GAAAAA GAT C-3′；2)对人白细胞cDNA文库进行PCR扩增：PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，所述PCR扩增反应管的组成为：200ng/ml cDNA 0.5μl2.5mM dNTPs 1μl25mM MgCl2 4μl20μM P1 0.5μl20μM P2 0.5μl5.0U/ul Taq酶 0.5μl10×PCR Buffer 5μlH2O 38μl总计 50μl；配制完成后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，60s变性反应；55℃，60s退火反应；72℃，60s扩增反应；进行30次循环，于72℃延伸10min；PCR产物用NdeI和BamHI双酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，命名为mutant IFNα-2b；按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码NGR导向肽的核酸片段，这两个片段退火后可形成含13个氨基酸的导向肽片段以及5’端和3’端的粘性末端即BamHI和SalI的切点；片段1：5’-GAT CCT GCA ACG GTC GTT GCG TGA GCG GTT GCGCGG GTC GTT GCT G-3’；片段2：5’-TCG ACC TAG CAA CGA CCC GCG CAA CCG CTC ACGCAA CGA CCG TTG CAG-3’；将合成的两个片段煮沸变性5min，然后退火，再与mutant IFNα-2b及用NdeI和SalI处理过的pET-22b(+)质粒连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，挑取阳性克隆，于LB培养液中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的IFNα-2b-NGR融合基因原核表达载体，进行DNA序列分析，测序正确者命名为pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR，其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与IFNα-2b融合蛋白的基因；3)重组蛋白的诱导表达：将测序正确的质粒pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取单克隆菌，于LB中30℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB培养基，其中含Amp 100μg/ml，37℃继续培养至OD650nm＝0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，3000rpm离心15min收集菌体，进行SDS-PAGE及Western Blot，对SDS-PAGE结果进行用薄层扫描以测定目的蛋白的表达量；4)重组蛋白的纯化：按1克菌体加入5ml的STE缓冲液，其配方为100mM NaCl，50mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，将菌体重悬，然后加入融菌酶0.5mg/g及DOC 5ug/g，室温搅拌30min；再加入DNase 20μg/g，静置20min后，4℃离心15min，12,000rpm，弃上清液，收集沉淀；用洗涤液3M Urea，2％TritonX-100，STE洗涤沉淀后，按1克菌体加入20ml洗涤液，4℃离心15min，12,000rpm，弃上清液，再收集沉淀；将沉淀在缓冲液中彻底溶解，缓冲液的配方为6.5M盐酸胍，1％β巯基乙醇，25mM Tris；对PBS透析24h，其PBS的pH为7.2，4℃离心10min，12,000rpm，收集到的上清用PBS充分平衡的亲和色谱层析柱层析纯化，洗脱液为0.1M甘氨酸，其pH为2.5，连续梯度洗脱5个柱床体积，收集洗脱液，进行活性测定和SDS-PAGE检测；5)重组蛋白的体外生物学活性检测：WISH细胞在含抗生素和谷氨酰胺的10％FSC，pH7.4的Eagle’s培养液中37℃培养，待细胞呈单层生长后，消化传代继续培养；将消化的WISH细胞，按1,000个细胞/孔接种于96孔板，37℃孵箱培养过夜，换入用含5％FCS的Eagle’s液稀释的不同浓度的IFN裂菌上清，继续培养，次日用含2％FCS的Eagle’s培养液按1∶10～1∶30稀释的VSV病毒培养液，换入细胞培养板，37℃培养24h，观察结果，以50％细胞保护的IFN稀释度为IFN效价。