大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法

摘要

一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，无菌条件下用无钙镁人工海水浸泡海绵样品并撕成1-3mm³小块，浸泡使海绵细胞及其共附生微生物分散于溶液中，静置、吸取上层混合细胞悬浮液，加入乙二胺四乙酸、十二烷基肌氨酸钠组成的碱性破壁缓冲液和含Ca²⁺的蛋白酶K溶液消化细胞壁，采用Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液以及氯仿、异戊醇混合溶液提取DNA，再加入醋酸钠及异丙醇得到DNA沉淀，70-75％乙醇洗涤、干燥、溶于TE缓冲液，采用RNase酶消解RNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA。本发明简单快捷，适合大于40000个碱基以上的海绵宏基因组DNA提取，可满足宏基因组文库构建和功能基因筛选的需要。

主权项

1.一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，其特征在于包括如下步骤：(1)海绵组织分散及混合细胞收集：在无菌条件下切取海绵组织，浸泡于无钙、镁的人工海水中撕成1-3mm3的小块，继续室温静置悬浮释放细胞，吸取上层悬浊液得到混合细胞样品；(2)破壁与DNA释放：将混合细胞样品离心得到混合细胞，加入碱性破壁缓冲液轻轻颠倒混匀，碱性破壁缓冲液pH 11.5，由50mM三羟甲基氨基甲烷、5mM乙二胺四乙酸、1％十二烷基肌氨酸钠构成，再加入蛋白酶K反应缓冲液处理，将pH值调回8.0，蛋白酶K反应缓冲液pH 3.0，由50mM三羟甲基氨基甲烷、15mM CaCl2构成，再加入蛋白酶K混匀后45-55℃水浴处理；(3)宏基因组大片段DNA的提取：在上述处理后的细胞溶液中加入三羟甲基氨基甲烷一饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液进行处理，三羟甲基氨基甲烷-饱和酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；离心取上清，加入氯仿、异戊醇混合溶液进行处理，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；离心得到上清，按照与上清液0.1-0.2倍体积的比例加入3M的醋酸钠并加入与上清液等体积的异丙醇，析出DNA；离心去除异丙醇，DNA沉淀用70-75％的乙醇洗涤，离心去除乙醇，干燥后DNA用TE缓冲液溶解，并用不含DNA酶的RNA酶35-40℃水浴消解去除RNA，最后用琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收大片段DNA。