人工合成长链DNA新方法

摘要

本发明提供了一种人工合成长链DNA新方法，本发明方法核心技术在于将DNA二级结构的特性引入到引物设计中，并结合新的逐步降温连接法(同时可采用连接酶链式反应或者T4连接酶反应)使位于同一条链上的各条引物与另一条链上的“桥”式单链寡核苷酸引物配对而按照特定的顺序连接起来，经过逐步降温连接反应(或40个连接酶链式反应循环或4－16度T4连接酶反应)后得到大量的单链DNA模板，然后再经过最后的PCR反应扩增出所需的DNA双链。本发明方法成本低、步骤简单、速度快，突变率低，有较大应用价值。

主权项

1.一种合成长链DNA新方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)合成基因序列的获得：以常规方法获得需要合成基因的序列；(2)引物1的选泽：依据计算机软件分析DNA二级结构，选出具有头尾同时游离特性的DNA序列作为引物1；(3)引物2的选泽：依据计算机软件分析DNA二级结构，选出头尾序列同时具有游离大于2bp而且二级结构极其简单特性的DNA序列作为引物2；(4)用DNA合成仪合成引物1和引物2；(5)按照同等比例混合所有的引物1和引物2；(6)高温变性：在94-95℃条件下维持2-30分钟；(7)配制高温连接酶反应体系：经过94-95℃，2-30分钟后逐步降至45℃以下；连接酶链式反应；或T4连接酶连接反应配制高温连接酶反应体系；(8)取出1/50的连接酶反应产物，加入双链扩增引物配制PCR反应体系；(9)按常规的PCR反应条件，合成双链DNA；(10)取出2-50ulPCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，利用DNA胶纯化试剂盒纯化目的基因片段。