一种获得产鬼臼毒素西藏八角莲的毛状根的方法、毛状根及后代

摘要

本发明提供了一种利用基因工程技术遗传转化西藏八角莲，获得生产鬼臼毒素的西藏八角莲的毛状根的方法。涉及包含发根农杆菌遗传转化西藏八角莲的方法，遗传转化获得可生产鬼臼毒素的西藏八角莲毛状根。其过程是用发根农杆菌遗传转化西藏八角莲，获得了西藏八角莲毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的西藏八角莲毛状根能够生产鬼臼毒素。本方法可以为鬼臼毒素的生产提供一种新型可持续的新型药源。

主权项

1.一种获得产鬼臼毒素西藏八角莲毛状根的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化西藏八角莲的器官，其步骤如下：(1)西藏八角莲无菌外植体的获得：(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到西藏八角莲器官中，其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化，步骤包括：A、活化发根农杆菌；B、发根农杆菌浸染西藏八角莲无菌外植体；C、发根农杆菌与西藏八角莲无菌外植体的共培养；D、西藏八角莲的除菌培养；(3)西藏八角莲毛状根的获得与继代培养；(4)西藏八角莲毛状根的分子检测；(5)西藏八角莲毛状根中鬼臼毒素的检测；其中：发根农杆菌与西藏八角莲无菌外植体的共培养的步骤如下：(1)将发根农杆菌接种于50ml YEB液体培养，YEB液体添加卡那霉素达到终浓度为100mg/L，28℃，200rpm振荡培养两次；(2)第二次活化OD600达0.3时，加100μmol/mL乙酰丁香酮，使其在农杆菌中的最终浓度为100μmol/mL，继续28℃，200rpm振荡培养，OD600达0.6时，室温下4000rpm离心l0分钟；(3)弃上清，菌体用MS液体培养基悬浮，乙酰丁香酮最终浓度为100μmol/mL，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD600＝0.3；称转化液，用于西藏八角莲的遗传转化；(4)取无菌西藏八角莲顶芽、侧芽、叶、茎、根植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm2，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，浸染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2天，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养；(5)西藏八角莲的除菌培养：共培养结束后转移至无植物生长调节物的MS固体培养基中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养，10天后，在西藏八角莲受伤的部位开始出现毛状根；(6)待从西藏八角莲转化外植体上诱导出的毛状根长到2cm时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2 MS固体培养基上继代培养；以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除；然后仅在1/2 MS固体培养基上继代培养；西藏八角莲毛状根的分子检测手段如下；(1)西藏八角莲毛状根基因组DNA的提取：1)取少量西藏八角莲毛状根，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer；2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其间经常颠倒混匀；3)12000rpm，室温离心10分钟；4)取上清液，加500ul饱和酚，用pH8.0的Tris-HCl进行饱和，吸取下层，轻轻混匀，4℃静置5分钟至分层；5)12000rpm，室温离心10min；6)吸上清250微升，加2倍体积的无水乙醇，-20℃储存，充分混匀，室温静置至DNA析出；7)8000rpm，4℃离心5分钟；8)用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置，使乙醇挥发完全；9)加50ul TE，其中100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.0，溶解DNA，37℃水浴1小时；10)加40ul氯仿一异戊醇混合液，其中氯仿∶异戊醇＝24∶1，轻轻混匀，静置5分钟至分层；11)12000rpm，室温离心10分钟；12)吸取上清35ul到新Eppendoff管中，-20℃保存，用于PCR检测；抽提缓冲液配方如下：100mM Tris-HCl pH8.02.5％v/v 巯基乙醇500mM NaCl20mM EDTA1.5％w/v SDS(2)西藏八角莲毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测：诱发并维持毛状根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上，rolB基因检测使用的上游引物为frolb 5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’，下游引物为rrolb5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’；rolC基因检测使用的上游引物为5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’，下游引物为rrolc 5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’；检测rolB和rolC的PCR程序为：94℃ 5min→34循环，94℃ for40sec→56℃ for40 sec→72℃for 1min→72℃ 6min；阳性对照为相应的工程菌，西藏八角莲的天然叶片作为阴性对照；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测，rolb的扩增条带大小为423 bp，rolC为626 bp。