含SOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法

摘要

含SOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法，包括提取家蚕总RNA，设计MnSOD引物，合成单链cDNA，合成MnSOD基因，将MnSOD基因与pFastBacHTa连接并转化XL－Blue细胞，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD；以家蚕杆状病毒DNA为模板，合成家蚕多角体基因，并将其克隆到pFastBac Dual plasmid质粒；将MnSOD基因插入双表达质粒的P10启动子下构建成双表达载体：Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；将其转染后提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA；在转染试剂脂质体介导下导入转染家蚕培养细胞，获得重组病毒。提供可以添食感染家蚕幼虫的病毒粒子，通过家蚕表达目的基因MnSOD，实现规模化和工业化生产。

主权项

1.含SOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法，其特征在于以下步骤：(1)取家蚕5龄第3天幼虫以RNA抽提试剂盒提取总RNA，设计MnSOD引物，正反向引物5’端分别引进EcoRI和KpnI酶切位点；(2)以总RNA为模板，在通用引物oligo-dT18和反向转录酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成单链cDNA；(3)以单链cDNA为模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，条件为94℃预变性5分钟，再以94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共35个循环，最后72℃延长10分钟；(4)合成的MnSOD基因经乙醇沉淀和EcoRI和KpnI双酶切，电泳并切胶回收；将MnSOD基因与pFastBacHTa以连接试剂盒连接并转化XL-Blue细胞，挑斑在含每毫升100μg氨苄青霉素的LB培养基中培养繁殖，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD；(5)以家蚕杆状病毒DNA为模板，以多角体启动子5’端和多角体基因3’设计引物，通过PCR方法合成家蚕多角体基因，并将其克隆到pFastBac Dual plasmid质粒；(6)以NcoI和KpnI限制性内切酶分别酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蚕多角体基因的双表达质粒，凝胶回收目的片段，将MnSOD基因插入双表达质粒的P10启动子下构建成双表达载体：Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；(7)将Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD转染到E.coli DH10Bac/BmNPV，37.5℃培养24～48小时，从中挑选独立的白斑，在每毫升含有50μg卡那霉素、7μg庆大霉素和10μg四环素的液体培养基上培养过夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA；(8)将上述提取的DNA，在转染试剂脂质体(Cellfectin)介导下导入转染家蚕培养细胞，获得重组病毒。